Estudos de indução e purificação de condroitinases de Flavobacterium heparinum
Nenhuma Miniatura disponível
Data
1999
Autores
Aguiar, Jair Adriano Kopke de [UNIFESP]
Orientadores
Michelacci, Yara Maria [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
O presente trabalho estabeleceu as melhores condicoes para o preparo das condroitinases de Flavobacterium heparinum. Foram realizados estudos sobre o crescimento bacteriano e a inducao enzimatica em diferentes meios de cultura, sobre as melhores condicoes para preparo de extrato bruto e foram estabelecidos metodos para a purificacao das condroitinases. O desenvolvimento de uma metodologia rapida para ensaio das enzimas, que se baseia na queda da metacromasia dos glicosaminoglicanos quando sao degradados, foi de grande importancia para a realizacao desses estudos. Para as analises do crescimento bacteriano e da inducao enzimatica, foram utilizados dois meios complexos (trypticase sem giicose e peptona) e um meio definido. Em todos os meios de cultura, a fase de crescimento exponencial foi seguida de uma fase estacionaria, que ocorreu mais tardiamente no meio definido que nos meios complexos. Embora as celulas de F. heparinum crescam bem em todos os meios utilizados, densidades celulares mais altas foram obtidas em trypticase sem glicose que nos demais meios. Em todos os meios de cultura, as atividades das enzimas que degradam condroitim sulfato e dermatam sulfato aumentaram muito quando a bacteria foi cultivada em presenca de condroitim 6-sulfato como indutor, embora a cinetica de crescimento bacteriano nao tenha sido afetada. Atividades enzimaticas maximas foram observadas proximo ao final da fase de crescimento exponencial. Em peptona, outro pico de atividade enzimatica apareceu, nas primeiras horas de crescimento bacteriano, tanto em presenca como em ausencia do indutor. Alem disso, nesse meio houve rapida queda na atividade das condroitinases durante a fase estacionaria. A concentracao minima de condroitim 6-sulfato capaz de induzir a expressao das condroitinases foi de 50 mg/L. Acima de 100 mg/L, pequeno aumento nas atividades enzimaticas foi observado. Dentre todos os glicosaminoglicanos utilizados como indutores, condroitim 6-sulfato foi o mais eficiente. Alem disso, oligossacarideos produzidos por quebra enzimatica de condroitim 4-sulfato tambem sao capazes de induzir as enzimas. Para o preparo de extrato bruto de F heparinum, a exposicao da suspensao bacteriana ao ultrassom (20 kHz) por periodos curtos de tempo (2 pulsos de 30 segundos) foi mais eficiente para solubilizacao das condroitinases que periodos mais longos. Para o fracionamento das condroitinases, dois metodos foram utilizados: cromatografia de adsorcao ...(au)
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 1999. 116 p. ilus.