Efeitos da deleção genética do receptor B1 de cininas sobre a captação de L-arginina em células endoteliais de camundongos

Abstract

Introdução. O Sistema Calicreína-Cininas é um importante fator modulador das funções cardiocirculatórias. Através de seus receptores, as cininas participam de vários processos fisiológicos, como vasodilatação, liberação de autacóides e inflamação. Os receptores B1 (induzível) e B2 (constitutivo) possuem baixa homologia e diferem significativamente quanto às respostas induzidas pelas diferentes cininas, sendo o receptor B2 ativado preferencialmente por bradicinina (BK) e o receptor B1 ativado pelo metabólito des-Arg9-BK. A ativação do receptor B1 no endotélio vascular leva, entre outros efeitos, à geração de óxido nítrico (NO), um radical livre gasoso que rapidamente se difunde para as células musculares lisas induzindo vasodilatação. A produção de NO ocorre através da oxidação de L-arginina (L-arg), um aminoácido catiônico que é internalizado principalmente pelo transportador CAT-1. JUSTIFICATIVA E Objetivos . Estudos recentes conduzidos pelo nosso grupo mostraram que o modelo nocaute para o receptor B1 (B1-/-) apresentava resposta reduzida à acetilcolina em preparações vasculares, além de níveis reduzidos de NO circulante e tecidual (Loiola, et al, 2011). Diante disso, o presente projeto propõe-se a investigar a influência de receptores B1 sobre captação de L-arg e a expressão do CAT-1 em camundongos selvagem e nocaute para o receptor B1. Para isso este foi quantificada a captação de L-arg por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), a expressão genética e proteica do transportador CAT-1 por ensaios quantitativos de reação em cadeia da polimerase (qPCR) e wetern-blot, respectivamente. Resultados . Como resultado, foi desenvolvido uma metodologia para se analisar a captação de L-arg em células endoteliais, e verificou-se que o CAT-1 está envolvido neste processo após ensaios com o bloqueador NEM (1mM), e foi observado que células endoteliais de camundongos B1-/- apresentaram uma marcante redução na captação de L-arg, em comparação ao tipo selvagens. Os ensaios de qPCR e western-blot produziram resultados semelhantes, mostrando que os camundongos B1-/- apresentam níveis reduzidos de expressão genética e proteica do CAT-1, o que explica, ao menos em parte, a menor captação de L-arg. Conclusão . A partir destes resultados podemos concluir que a redução dos níveis de NO encontrados em animais nocaute para o receptor B1 se deve, pelo menos em parte, a uma reduzida captação de L-arginina, causada provavelmente por níveis reduzidos da expressão de CAT-1.

INTRODUCTION The kallikrein-kinin system is an important modulating factor of the cardiovascular functions. Through its receptors, the kinins participate in several physiological processes, such as vasodilation, autacoids release and inflammation. The B1 (inducible) and B2 (constitutive) receptors have low homology and differ significantly in the responses induced by the different kinins, as the B2 receptor activated mainly by the bradykinin (BK) and the B1 receptor activated by the metabolit des-Arg9 -BK. The activation of B1 receptor in the vascular endothelium leads to, among other effects, the generation of nitric oxide (NO), a gas free radical that rapidly diffuses into smooth muscle cells inducing vasodilation. The production of NO occurs through the oxidation of L-arginine (L-arg), an cationic amino acid that is mainly uptake by the cationic amino acid transporter 1 (CAT-1). JUSTIFICATIVE AND OBJECTIVES Recent studies, conducted by our group, have shown that the knockout model for the B1 receptor (B1 -/- ) exhibited a reduced response to acetylcholine in vascular preparations, and reduced circulating and tissue NO levels (Loiola, et al, 2011). Therefore, this project proposes to investigate the influence of B1 receptors on L-arg uptake and on the expression of CAT-1 in wild type and B1 receptor knockout mice. This work has measured the uptake of L-arg by liquid chromatography, the gene and protein expression of the CAT-1 carrier by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and Wetern-blot, respectively. RESULTS As a result, we developed a new methodology to analyze the uptake of L-arg in endothelial cells, showing that the CAT-1 is involved in this process, after trials with the pharmacological blocker NEM (1mM), and observed that endothelial B1 -/- cells showed a marked reduction in L-arg uptake compared to the wild type. qPCR and western-blot assays yielded similar results and showed that B1 -/- cells exhibit lower levels of CAT-1 expression, which explains the lower uptake level of L-arg. CONCLUSION From these results we conclude that the reduction in NO levels found in knockout animals for the B1 receptor is due to, at least in part, a reduced uptake of Larg, probably caused by reduced expression levels of CAT-1.