Padronização da técnica de espectrometria de massa por dessorção e ionização a laser - assistida por matriz para a detecção das proteínas de membrana externa em Klebsiella pneumoniae
Data
2015-01-26
Autores
Silva, Ana Carolina Ramos da 
Orientadores
Gales, Ana Cristina
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Objetivo: A presente dissertação de mestrado teve como objetivo padronizar a detecção da porina OmpK36 em isolados de K. pneumoniae pela metodologia de espectrometria de massa por MALDI-TOF. Métodos: A reprodutibilidade e padronização da técnica foi avaliada por três extratos proteicos do controle 192 que expressa a OmpK36 e dos isolados clínicos 7726 e 7461 com seus respetivos DLs 7726-1 e 7461-4 pelo MALDI-TOF MS. Após padronização da técnica as amostras K1, K2, K3, 7008 e 51281 foram analisadas por essa metodologia. Os isolados clínicos de K. pneumoniae 7726 e 7461 que não expressavam as porinas OmpK35 e a OmpK36 foram selecionados e submetidos a transformação pela técnica de eletroporação. Uma cepa de K.pneumoniae portadora do plasmídeo pSHA2 carreador do gene ompK36 foi utilizado para transferir o gene dessa porina originando os DLs 7726-1 e 7461-4. A expressão e avaliação do perfil proteico dos isolados transformados foi avaliado por extração plasmidial e, assim, como os isolados clínicos que foram avaliados pelas técnicas de SDS-PAGE, qRT PCR, PCR e sequenciamento, e comparado com a detecção da OmpK36 pela técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF. Resultados: Após a introdução da OmpK36 por transformação, os respectivos DLs 7726-1 e 7461-4 apresentaram um pico proteico de 37,5 kDa pela técnica de MALDI-TOF MS. A transferência foi fortemente evidenciada pela inclusão de uma nova banda no gel de SDS-PAGE com aproximadamente 36 kDa e a expressão relativa da OmpK36 nos DLs 7726-1 e 7461-4, que foram respectivamente 2.919 e 1.993 vezes superiores que as cepas originais 7726 e 7461, respectivamente. Nos isolados clínicos, a expressão da OmpK36 pela espectrometria de massa evidenciou o pico de massa ao redor de 37 m/z. A detecção dessa OMP por espectrometria de massa apresentou alta reprodutibilidade quando os extratos proteicos foram analisados em períodos diferentes. Conclusão: A técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF demonstrou ser rápida, acurada e reprodutível para determinar o perfil proteico da OmpK36.
This study aimed to detect the main outer membrane proteins of K. pneumoniae clinical isolates by MALDI-TOF mass spectrometry. The standardization and reproducibility of the technique was assessed using protein extracts of the control strain 192 and clinical isolates 7726 and 7461 along with their respective laboratorial derivative strains, 7726-1 and 7461-4. After technical standardization five K. pneumoniae clinical isolates (K1, K2, K3, 7008 and 51281) were studied. K. pneumoniae clinical isolates 7726 and 7461 lacking both OmpK35 and OmpK36 porins were submitted to electroporation technique. The plasmid pSHA2 carrying ompK36 gene was transferred to the DLs strains, 7461-4 and 7726-1. The expression and evaluation of protein profiles of all isolates were evaluated by SDS-PAGE, qRT-PCR, and PCR and sequencing of the OmpK35, OmpK36, OmpA, OmpK26, LamB and PhoE encoding genes. The results of all techniques were compared to the mass spectrum results obtained by MALDI-TOF. The outer membrane protein profile of the DL strains 7461-4 and 7726-1 showed a peak of 37.5 x 103 m/z by MALDI-TOF MS. The presence of the OmpK36 protein was also observed by SDS-PAGE and its expression by qRT-PCR. The relative expression of ompK36 gene in the DLs 7461-4 and 7726-1 was 2,919 and 1,993 times higher than those of the original strains 7726 and 7461, respectively. A mass peak of ~37 x 103 m/z by mass spectrometry corresponded to OmpK36 was observed among clinical isolates expressing this porin. The detection of OMP by mass spectrometry was highly reproducible. Our results showed that MALDI-TOF mass spectrometry proved to be rapid, reproducible and accurate to determine the presence of the OmpK36 protein, however, additional experiments are required to characterize the peak profile of the remaining outer membrane proteins in K. pneumoniae isolates.
This study aimed to detect the main outer membrane proteins of K. pneumoniae clinical isolates by MALDI-TOF mass spectrometry. The standardization and reproducibility of the technique was assessed using protein extracts of the control strain 192 and clinical isolates 7726 and 7461 along with their respective laboratorial derivative strains, 7726-1 and 7461-4. After technical standardization five K. pneumoniae clinical isolates (K1, K2, K3, 7008 and 51281) were studied. K. pneumoniae clinical isolates 7726 and 7461 lacking both OmpK35 and OmpK36 porins were submitted to electroporation technique. The plasmid pSHA2 carrying ompK36 gene was transferred to the DLs strains, 7461-4 and 7726-1. The expression and evaluation of protein profiles of all isolates were evaluated by SDS-PAGE, qRT-PCR, and PCR and sequencing of the OmpK35, OmpK36, OmpA, OmpK26, LamB and PhoE encoding genes. The results of all techniques were compared to the mass spectrum results obtained by MALDI-TOF. The outer membrane protein profile of the DL strains 7461-4 and 7726-1 showed a peak of 37.5 x 103 m/z by MALDI-TOF MS. The presence of the OmpK36 protein was also observed by SDS-PAGE and its expression by qRT-PCR. The relative expression of ompK36 gene in the DLs 7461-4 and 7726-1 was 2,919 and 1,993 times higher than those of the original strains 7726 and 7461, respectively. A mass peak of ~37 x 103 m/z by mass spectrometry corresponded to OmpK36 was observed among clinical isolates expressing this porin. The detection of OMP by mass spectrometry was highly reproducible. Our results showed that MALDI-TOF mass spectrometry proved to be rapid, reproducible and accurate to determine the presence of the OmpK36 protein, however, additional experiments are required to characterize the peak profile of the remaining outer membrane proteins in K. pneumoniae isolates.
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Citação
SILVA, Ana Carolina Ramos da. Padronização da técnica de espectrometria de massa por dessorção e ionização a laser - assistida por matriz para a detecção das proteínas de membrana externa em klebsiella pneumoniae. 2015. 148 f. Dissertação (Mestrado em Infectologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.