Estudo das propriedades da membrana e sua influência na fusão de lipossomas catiônicos fusogênicos com vesículas biomiméticas

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Data
2022-07-15
Autores
Cavalcanti, Rafaela Ramos Mororó [UNIFESP]
Orientadores
Riske, Karin do Amaral [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
Lipossomas são vesículas lipídicas comumente utilizadas como modelo estrutural de membranas biológicas e carreadores de fármacos. A fim de melhorar sua capacidade de entrega intracelular, um sistema de lipossomas fusogênicos composto pelos lipídios DOTAP (catiônico) e DOPE (zwitteriônico) foi desenvolvido anteriormente e tem como principal rota de entrega a fusão de membranas. Este trabalho de doutorado direto teve como objetivo principal a investigação das propriedades da membrana (e.g, carga superficial e fase de membrana) e sua influência na eficiência de fusão desses lipossomas fusogênicos com vesículas biomiméticas (também chamadas de vesículas aceptoras). A eficiência de fusão foi analisada após mistura de vesículas unilamelares grandes (LUVs) do sistema fusogênico com o sistema aceptor formado por LUVs ou por vesículas unilamelares gigantes (GUVs). A carga superficial foi modulada a partir da variação na fração molar de um lipídio negativo (POPG), enquanto que a fase da membrana foi controlada a partir da adição de colesterol (fase líquido-ordenada, Lo) e de lipídios com diferentes temperaturas de transição de fase gel-fluida (Tm) (nas fases líquido-desordenada e sólido-ordenada, Ld e So). Mais especificamente, as vesículas aceptoras foram compostas pela mistura de POPC:POPG (fase Ld) e DPPC:DPPG (fase So) com e sem colesterol, assim como pelas misturas de POPC:DPPG e POPG:DPPC (coexistência das fases Ld/So). Além disso, uma nova composição de sistema fusogênico foi proposta com os lipídios DMTAP e DMPE, os quais possuem Tm ≈ 40 oC. Alterações no tamanho e carga superficial foram observadas utilizando o espalhamento de luz dinâmico (DLS) e potencial zeta. A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi utilizada para definir a entalpia de ligação entre os sistemas. Experimentos de calorimetria diferencial de varredura (DSC) e anisotropia de sonda fluorescente foram feitos para avaliar o comportamento térmico e grau de ordenamento das misturas, respectivamente. As microscopias ópticas convencional e confocal foram utilizadas para investigar a eficiência de fusão. As medidas de DLS, potencial zeta e ITC mostraram que a eficiência de fusão entre LUVs na fase Ld era dependente da concentração de POPG, e que esse processo era do tipo exotérmico. A adição de colesterol pareceu não interferir na eficiência de fusão; entretanto, a presença do colesterol adicionou uma componente endotérmica à interação do sistema fusogênico-aceptor. Ainda, os experimentos de anisotropia da sonda fluorescente mostraram que o grau de ordenamento Ld/Lo < So/Lo. A alta eficiência de fusão entre as LUVs fusogênicas e ambos sistemas de GUVs com a coexistência das fases Ld/So resultou na dissolução dos domínios. Por fim, a nova composição do sistema fusogênico apresentou uma alta eficiência de fusão com GUVs carregadas negativamente. Portanto, a fase da membrana, assim como sua carga superficial, alteram a eficiência de fusão de lipossomas fusogênicos e vesículas biomiméticas. A modulação dessas propriedades da membrana possibilita o controle da fusão de sistemas carreadores – e portanto a entrega intracelular do material encapsulado – com a célula.
Liposomes have been used as a biological model membrane in many biophysical and biochemical studies. To optimize the intracellular delivery, a liposomal system composed of the equimolar mixture of the lipids DOTAP (cationic) and DOPE (zwitterionic) was previously developed. The preferable route of this liposomal system, which is through membrane fusion, leads to an efficient intracellular delivery. The main goal of this PhD project was to investigate the properties of the membrane (e.g., charge and phase/packing) and its influence in the membrane fusion efficiency of these fusogenic liposomes with biomimetic vesicles (also called here acceptor vesicles). Fusion efficiency was investigated after incubation of large unilamellar vesicles (LUVs) composed of the fusogenic with the acceptor system forming both LUVs and giant unilamellar vesicles (GUVs). The membrane charged was modulated by using different concentration of an anionic lipid (POPG), while the phase of the membrane was modulated by adding cholesterol (liquid-ordered phase, Lo) and lipids with different melting transition temperatures (Tm) (liquid-disordered, Ld, and solid-disorder, So, phases). More specifically, the acceptor vesicles were composed of the mixture of POPC:POPG (Ld phase) and DPPC:DPPG (So phase) with and without cholesterol, as well as the mixture of POPC:DPPG and POPG:DPPC (Ld/So phase coexistence). Besides, a new fusogenic composition was proposed using DMTAP and DMPE lipids, which exhibit Tm ≈ 40 oC. The changes in the size and surface were measured using dynamic light scattering (DLS) and zeta potential. The isothermal titration calorimetry (ITC) was used to define the binding enthalpy between the systems. To assess the thermal behavior and membrane order of the mixtures, experiments using differential scanning calorimetry (DSC) and anisotropy were performed. To assess membrane fusion efficiency, multiple optical microscopy techniques were used, such as phase contrast and confocal. The experiments using DLS, zeta potential and ITC showed that membrane fusion was dependent on the molar fraction of POPG, and that this process was exothermic. The addition of cholesterol did not seem to change membrane fusion efficiency; however, the presence of cholesterol added an endothermic component to the fusogenic-acceptor interaction. The fluorescence anisotropy measurements demonstrated a membrane order degree Ld/Lo < So/Lo. High membrane fusion efficiency between the fusogenic liposomes and both compositions of the acceptor vesicles with the Ld/So phase coexistence led to the dissolution of the phase domains. At last, it was observed high membrane fusion efficiency of the new fusogenic composition with negatively charged GUVs. Thus, membrane phase, as well as the surface charge, change the membrane fusion efficiency of fusogenic liposomes and acceptor vesicles. The modulation of these membrane properties can control the fusion of carrier systems, and, therefore, the intracellular delivery of the encapsulated material.
Descrição
Citação
CAVALCANTI, R.M.M. Estudo das propriedades da membrana e sua influência na fusão de lipossomas catiônicos fusogênicos com vesículas biomiméticas. São Paulo, 2022. 116 f. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) - Escola Paulista de Medicina (EPM), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). São Paulo, 2022.