Heparanase e biomarcadores inflamatórios na degeneração do disco intervertebral
Data
2014-02-26
Autores
Oliveira, Lilian Zerbinatti de 
Orientadores
Pinhal, Maria Aparecida da Silva Pinhal
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Low back pain affects about 10 million Brazilians. Its intensity can vary from mild discomfort to debilitating long term pain. Many studies point to intervertebral disc degeneration as the main cause of low back pain. The degenerative process of the discs is associated with loss of extracellular matrix molecules and inflammatory mechanisms that lead to changes in the biochemical and biomechanical properties of the tissue. MRI is the most used method for the diagnosis of disc degeneration. However, some authors believe that this method does not reflect clear changes in disc morphology. The identification of biomarkers is fundamental to the approach of disc degeneration, particularly in the early stages of the disease, when the resonance images do not show changes. The increase in heparanase isoforms expressions in degenerated discs, the involvement of heparanase in inflarnmatory processes and the need for biomarkers for the diagnosis of degeneration, led us quantifying the protein expression and mRNA isoforms of heparanase in intervertebral discs with different degeneration grades according to Pfirrmann's grading system and evaluating three candidate biomarkers of inflammation in the serum of patients with the disease, which are interleukin-6 (IL-6), hyaluronic acid (HA) and cathepsin B (CatB). These compounds were evaluated by immunohistochemistry, mRNA expression and serum levels. For this purpose, we used peripheral blood aliquots and intervertebral disc biopsies of patients with disc degeneration, healthy individuais (non-affected by the disease) and patients who suffered accidental fracture of the spine. Results of study from our group demonstrated increased expression of heparanase isoforms, HPSE1 and HPSE2, suggesting a role for these proteins in extracellular matrix remodeling and chronic inflammation, characteristics of the disease. Expression of heparanase protein isoforms, given by quantification of the immunohistochemical reactions, were significantly increased in proportion to disc degeneration grade. Similarly, the mRNA expression of HPSE1 and HPSE2 was significantly higher in degenerated discs than in non-degenerate ones, suggesting that these proteins correlated with disease progression. Plasma levels of IL-6 were significantly higher in patients with disc degeneration compared to healthy subjects and this result reflects the profile of this cytokine in the disc tissue, confirmed by immunohistochemistry. Like IL-6, serum levels of HA were significantly higher in patients with disc degeneration when compared to healthy individuais, which can be explained by the significant reduction in m,RNAexpression of hyaluronidase isoforms in these patients, as evidenced by qRT-PCR and which may impair the clearance of HA in the blood. Despite the increased protein expression of CatB in degenerated discs tissue compared to non-degenerated discs, serum CatB activity was not significantly different between groups. Together, our data suggest that CatB does not represent a characteristic marker of the chronic inflammation process of the disc degeneration, while IL-6 and HA are potencial biomarkers for the prognosis/diagnosis of the disease, as well as the increased expression of heparanase isoforms.
Cerca de 10 milhões de brasileiros são acometidos pela dor lombar, cuja intensidade pode variar de um leve desconforto a dores incapacitantes e de longa duração. Muitos estudos apontam a degeneração do disco intervertebral como a principal causa de dor lombar. O processo degenerativo dos discos está associado à perda de moléculas da matriz extracelular e a mecanismos inflamatórios, que levam a alterações nas propriedades bioquímicas e biomecânicas do tecido. A ressonância magnética é o método mais utilizado para o diagnóstico da degeneração discal. Porém, alguns autores acreditam que este método não reflete alterações claras na morfologia do disco. A identificação de biomarcadores é fundamental para a abordagem da degeneração do discal, principalmente nos estágios iniciais da doença, quando as imagens de ressonância ainda não mostram alterações. Visto que há aumento de HPSE1 e HPSE2 em discos degenerados, dada a participação da heparanase em processos inflamatórios ea necessidade de biomarcadores para o diagnóstico da degeneração, tivemos o interesse em quantificar as expressões proteica e do RNAm das isoformas da heparanase em discos intervertebrais com diferentes graus de degeneração segundo a classificação de Pfirrmann e avaliar três candidatos a biomarcadores da inflamação no plasma de portadores da doença, que são interleucina-6 (lL-6), ácido hialurônico (AH) e catepsina B (CatB). Tais compostos foram avaliados por imunohistoquímica, expressão do RNAm e dosagens plasmáticas. Para isto, utilizamos alíquotas de sangue periférico e biópsias do disco intervertebral de pacientes com degeneração discal, pacientes saudáveis (não acometidos pela doença) e pacientes que sofreram fraturas acidentais da coluna vertebral. Resultados de estudo de nosso grupo evidenciaram o aumento da expressão das isoformas da heparanase, HPSE1 e HPSE2, sugerindo a participação destas proteínas no remodelamento da matriz extracelular e inflamação crônica, características da doença. A expressão proteica das isoformas da heparanase, por quantificação de reações de imunohistoqulmica, apresentou aumento significativo proporcional ao grau de degeneração dos discos. Similarmente, a expressão do RNAm de HPSE1 e HPSE2, foi significativamente maior em discos degenerados do que nos não degenerados, sugerindo uma correlação destas proteínas com o avanço da doença. Os níveis plasmáticos de IL-6 foram significativamente maiores em pacientes com degeneração discal comparativamente com indivíduos saudáveis e este resultado reflete o perfil desta citocina no tecido do disco, confirmado por imunohistoquímica. Assim como a IL-e6, os níveis plasmáticos de AH foram significativamente maiores em pacientes com degeneração disca! em comparação com indivíduos saudáveis, o que pode ser explicado pela redução significativa da expressão do RNAm das isoformas da hialuronidase (HYAL 1 e HYAL2). Apesar do aumento da expressão proteica de CatB no tecido de discos degenerados em relação aos discos não degenerados, tal diferença não foi observada quando avaliamos a atividade plasmática de CatB. Os dados deste estudo sugerem que a CatB parece não representar um marcador característico do processo de inflamação crônica na degeneração discal, enquanto IL-6 e AH são potenciais biomarcadores para prognóstico/diagnóstico da doença, bem como a expressão aumentada das
Cerca de 10 milhões de brasileiros são acometidos pela dor lombar, cuja intensidade pode variar de um leve desconforto a dores incapacitantes e de longa duração. Muitos estudos apontam a degeneração do disco intervertebral como a principal causa de dor lombar. O processo degenerativo dos discos está associado à perda de moléculas da matriz extracelular e a mecanismos inflamatórios, que levam a alterações nas propriedades bioquímicas e biomecânicas do tecido. A ressonância magnética é o método mais utilizado para o diagnóstico da degeneração discal. Porém, alguns autores acreditam que este método não reflete alterações claras na morfologia do disco. A identificação de biomarcadores é fundamental para a abordagem da degeneração do discal, principalmente nos estágios iniciais da doença, quando as imagens de ressonância ainda não mostram alterações. Visto que há aumento de HPSE1 e HPSE2 em discos degenerados, dada a participação da heparanase em processos inflamatórios ea necessidade de biomarcadores para o diagnóstico da degeneração, tivemos o interesse em quantificar as expressões proteica e do RNAm das isoformas da heparanase em discos intervertebrais com diferentes graus de degeneração segundo a classificação de Pfirrmann e avaliar três candidatos a biomarcadores da inflamação no plasma de portadores da doença, que são interleucina-6 (lL-6), ácido hialurônico (AH) e catepsina B (CatB). Tais compostos foram avaliados por imunohistoquímica, expressão do RNAm e dosagens plasmáticas. Para isto, utilizamos alíquotas de sangue periférico e biópsias do disco intervertebral de pacientes com degeneração discal, pacientes saudáveis (não acometidos pela doença) e pacientes que sofreram fraturas acidentais da coluna vertebral. Resultados de estudo de nosso grupo evidenciaram o aumento da expressão das isoformas da heparanase, HPSE1 e HPSE2, sugerindo a participação destas proteínas no remodelamento da matriz extracelular e inflamação crônica, características da doença. A expressão proteica das isoformas da heparanase, por quantificação de reações de imunohistoqulmica, apresentou aumento significativo proporcional ao grau de degeneração dos discos. Similarmente, a expressão do RNAm de HPSE1 e HPSE2, foi significativamente maior em discos degenerados do que nos não degenerados, sugerindo uma correlação destas proteínas com o avanço da doença. Os níveis plasmáticos de IL-6 foram significativamente maiores em pacientes com degeneração discal comparativamente com indivíduos saudáveis e este resultado reflete o perfil desta citocina no tecido do disco, confirmado por imunohistoquímica. Assim como a IL-e6, os níveis plasmáticos de AH foram significativamente maiores em pacientes com degeneração disca! em comparação com indivíduos saudáveis, o que pode ser explicado pela redução significativa da expressão do RNAm das isoformas da hialuronidase (HYAL 1 e HYAL2). Apesar do aumento da expressão proteica de CatB no tecido de discos degenerados em relação aos discos não degenerados, tal diferença não foi observada quando avaliamos a atividade plasmática de CatB. Os dados deste estudo sugerem que a CatB parece não representar um marcador característico do processo de inflamação crônica na degeneração discal, enquanto IL-6 e AH são potenciais biomarcadores para prognóstico/diagnóstico da doença, bem como a expressão aumentada das
Descrição
Citação
OLIVEIRA, Lilian Zerbinatti de. Heparanase e biomarcadores inflamatórios na degeneração do disco intervertebral. 2014. 114 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.