Avaliação do efeito da riboflavina e luz ultravioleta sobre os ceratócitos e luz ultravioleta sobre os ceratócitos in vitro
Data
2013-07-31
Autores
Covre, Joyce Luciana 
Orientadores
Sato, Elcio Hideo
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Purpose: Obtain culture of human keratocytes quiescent and evaluate the riboflavin and ultraviolet light effect on human keratocytes cultivated in vitro. Methods: Keratocytes were obtained from human corneal rims remnants of tissue previously used in corneal transplants at the Department of Ophthalmology of UNIFESP/EPM, and cultured in DMEM/F12 medium with FBS until confluence. The cell cultures were characterized by immunofluorescence with antibodies to K3 (epithelial marker), Thy 1(fibroblast marker), ?-SMA (myofibroblast), Lumican (keratocyte markers) Immunoflufluorescence was also perfomed after treatment. The corneal stroma cells were covered with collagen (200?L and 500 ?L) and 0.1% of riboflavin and were exposed to ultraviolet light (UV) for 30 minutes. After 24 hours, cytotoxicity was determined by MTT assay and cell viability was performed with dye Hoechst 33342/Propidium Iodide. Results: Cell cultures reached confluence in about 20 days. Immunofluorescence pointed higher expression for keratocyte markers (Lumican) and low expression for epithelial (K3), fibroblast (Thy 1) and myofibroblast (alpha-SMA) markers. After crosslinking, MTT analysis showed that cells had low rates of toxicity and dyed cells with Hoechst 33342/Propidium Iodide had low rates of apoptosis and necrosis respectively in all groups that contained collagen. Conclusion: Keratocytes cultures were successfully obtained and characterized by immunofluorescence to Lumican. MTT assay and staining with Hoechst 33342 and propidium iodide showed a higher rate of cell death in the groups not containing collagen, proving that protects cells against the effects of UVA light.
Objetivo: Obter cultura de ceratócitos humanos quiescentes e avaliar o efeito da aplicação da luz UVA e riboflavina sobre ceratócitos da córnea humana in vitro. Methodos: Os ceratócitos foram obtidos a partir das rimas corneoesclerais remanescentes da trepanação de córneas previamente utilizadas em cirurgias de transplante de córnea no Centro Cirúrgico do Departamento de Oftalmologia da EPM/UNIFESP, e cultivadas em meio DMEM/F12 com 2% de FBS até atingir confluência. As culturas de células foram caracterizadas por imunofluorescência com os anticorpos K3 (marcador de células epiteliais), Thy-1 (marcador de fibroblasto) SMA (marcador de miofibroblasto) e Lumican (marcador de ceratócitos). Imunoflurescência também foi feita após o tratamento. As células do estroma da córnea foram cobertas com colágeno (200?L e 500 ?L) e 0,1 % de riboflavina e exposta a luz UVA a 370nm por 30 minutos. Após 24 horas, citotoxicidade foi determinada por ensaio de MTT e a viabilidade celular foi feita por Hoechst 33342/Iodeto de propideo. Resultados: As culturas de células atingiram confluência em aproximadamente 20 dias. Imunofluorescência apontou alta expressão para o marcador de ceratócitos (Lumican) e expressão negativa par os marcadores de células epiteliais (K3), fibroblasto (Thy-1) e miofibroblasto (?-SMA). Após o cross linking a análise de MTT mostrou baixa taxa de toxicidade e com a coloração de Hoechst 33342/Iodeto de propideo baixa taxa de apoptose e necrose respectivamente em todos os grupos que continham colágeno. Conclusão: As culturas de ceratócitos foram obtidas e caracterizadas por imunofluorescência através do marcador Lumican com sucesso. O ensaio de MTT e a coloração por Hoechst 33342 e iodeto de propídio, apresentaram maior índice de morte celular nos grupos que não continha colágeno, provando que protege as células contra os efeitos da luz UVA.
Objetivo: Obter cultura de ceratócitos humanos quiescentes e avaliar o efeito da aplicação da luz UVA e riboflavina sobre ceratócitos da córnea humana in vitro. Methodos: Os ceratócitos foram obtidos a partir das rimas corneoesclerais remanescentes da trepanação de córneas previamente utilizadas em cirurgias de transplante de córnea no Centro Cirúrgico do Departamento de Oftalmologia da EPM/UNIFESP, e cultivadas em meio DMEM/F12 com 2% de FBS até atingir confluência. As culturas de células foram caracterizadas por imunofluorescência com os anticorpos K3 (marcador de células epiteliais), Thy-1 (marcador de fibroblasto) SMA (marcador de miofibroblasto) e Lumican (marcador de ceratócitos). Imunoflurescência também foi feita após o tratamento. As células do estroma da córnea foram cobertas com colágeno (200?L e 500 ?L) e 0,1 % de riboflavina e exposta a luz UVA a 370nm por 30 minutos. Após 24 horas, citotoxicidade foi determinada por ensaio de MTT e a viabilidade celular foi feita por Hoechst 33342/Iodeto de propideo. Resultados: As culturas de células atingiram confluência em aproximadamente 20 dias. Imunofluorescência apontou alta expressão para o marcador de ceratócitos (Lumican) e expressão negativa par os marcadores de células epiteliais (K3), fibroblasto (Thy-1) e miofibroblasto (?-SMA). Após o cross linking a análise de MTT mostrou baixa taxa de toxicidade e com a coloração de Hoechst 33342/Iodeto de propideo baixa taxa de apoptose e necrose respectivamente em todos os grupos que continham colágeno. Conclusão: As culturas de ceratócitos foram obtidas e caracterizadas por imunofluorescência através do marcador Lumican com sucesso. O ensaio de MTT e a coloração por Hoechst 33342 e iodeto de propídio, apresentaram maior índice de morte celular nos grupos que não continha colágeno, provando que protege as células contra os efeitos da luz UVA.
Descrição
Citação
COVRE, Joyce Luciana. Avaliação do efeito da riboflavina e luz ultravioleta sobre os ceratócitos e luz ultravioleta sobre os ceratócitos in vitro. 2013. 32 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2013.