O efeito da sinalização via o receptor beta 2 adrenérgico no perfil de citocinas produzidas pelas células dendríticas: impacto na diferenciação de células t cd4 +
Data
2014-12-31
Autores
Takenaka, Maisa Carla Silveira 
Orientadores
Basso, Alexandre Salgado Basso
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Although it is well established that norepinephrine, via ?2-adrenergic receptor signaling, inhibits pro -inflammatory cytokines and enhances the IL -10 production by LPS -stimulated dendritic cells, its impact in the CD4+ T helper cell differentiation has not been elucidated. The cytokines produced by dendritic cells are important to or chestrate the differentiation of Th subsets, being IL -12p70 and IL - 23 important to Th1 and Th17 immune responses, respectively. Objective: To verify how ?2-adrenergic receptor signaling may modulate the IL-12p70 and IL -23 production by LPS -stimulated dendritic cells and whether or not this modulation impact the adaptive immune response. Methods: Dendritic cells were generated from C57BL/6 , IL -10- / - and ?-arrestina 2- / - bone marrow cells cultivated in the presence of GM-CSF. On 9th day, the immature dendritic cell cultures were treated or not with the ?2 -adrenergic receptor agonist for 1 hour and then activa ted with LPS for 18 hours. In some experiments, cells were pre -treated with ?2- and ?2-adrenergic receptor antagonist s or a PKA inhibitor for 15 minutes and then stimulated as mentioned above. After stimulation, the supernatants were collected and IL-12p70 , IL -23, IL -6, and IL-10 production was analyzed by ELISA. To analyze the molecular mechanism involved in the phenomena observed due to ?2-adrenergic receptor signaling during LPS-induced dendritic cell activation we evaluated the relative gene expression of Il12a, Il12b and Il23a by qPCR, as well as, the activation of NF-?B and AP-1 signaling pathways using western-blotting. Finally, naïve CD4+ T cells sorted by flow cytometry and immatur e dendritic cells or LPS-activated dendritic cells (treated or not with ?2-adrenergic receptor agonist) were co-cultured with soluble anti -CD3 antibody. After 3 days, T cell proliferation was analyzed by f low cytometer and IFN -?, IL -17A production was anal yzed by ELISA. Results: As expected, LPS-activated dendritic cells produce higher levels of IL -12p70 than IL -23. The ?2-adrenergic receptor agonist treatment inhibits the IL-12p70 and IL -6, while increases the IL -10 production in LPS -stimulated dendritic cells, inverting the IL -12p70/IL -23 ratio in favor of IL-23. Likewise, the gene expression analysis showed that the ?2-adrenergic receptor signaling in LPS-activated DC induced down-regulation of Il12a, Il12b and up-regulation of Il23a expression when compared with non -treated LPS -activated DC. Moreover, the ?2-adrenergic receptor signaling inhibited I ?B?- phosphorylation, the nuclear translocation of NF-?B (p65 ) and c-Jun -phosphorylation induced by LPS in the dendritic cells. ?2-adrenergic receptor -mediated IL -12p70 inhibition occurred in an IL -10- and PKA- independent manner, but was partially dependent on ?-arrestin 2. Finally, ?2-adrenergic receptor signaling in LPS-stimulated dendritic cells did not interfere in their ability to induce T cell proliferation but did impact the way DC drive T helper cell differentiation, inhibiting IFN-? and increasing IL -17A production by T cells. Conclusion: The ?2-adrenergic receptor signaling in LPS -stimulated dendritic cells inhibited NF-?B and AP -1 activation, which are important for the IL -12p70 production. The inhibition of NF-?B signaling pathway was partially mediated by ?-arrestin 2. The IL -12p70 inhibition mediated by ?2-adrenergic receptor signaling inverted the IL -12p70 / IL-23 ratio in LPS -stimulated dendritic cells , impairing Th1 development and favoring Th17 differentiation.
Apesar de já bem estabelecido que sinalização da noradrenalina via o receptor ?2 -adrenérgico inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias e aumenta a produção de IL -10 pelas células dendríticas ativadas com LPS, ainda não há estudos conclusivos mostran do se essa mudança no perfil de citocinas produzidas pelas células dendríticas pode ter um efeito na resposta imune adaptativa, do ponto de vista da diferenciação dos subtipos de células T CD4 +. Durante a ativação e diferenciação das células T CD4 + as cito cinas produzidas pelas células dendríticas influenciam na polarização dos diferentes subtipos de células T helper, sendo a IL -12p70 e a IL -23 importantes para a diferenciação de células Th1 e Th17, respectivamente. Objetivo: Avaliar o efeito da sinalização pelo receptor ?2 -adrenérgico na produção de IL -12p70 e IL -23 pelas células dendríticas ativadas com LPS, os mecanismos moleculares envolvidos e suas consequências na resposta imune adquirida. Métodos: Células dendríticas de camundongos C57BL6, IL-10 - / - e ?-arrestina 2 - / - foram geradas a partir de cultura de células da medula óssea com GM-CSF. No 9° dia de cultura, as células dendríticas imaturas foram tratadas ou não com agonista do receptor ?2 -adrenérgico por 1 hora e estimuladas com LPS por 18 horas. Em alguns exp erimentos, as células foram pré -tratadas com inibidor de PKA ou com antagonistas dos receptores ?2- e ?2 -adrenérgicos por 15 minutos e estimuladas como descrito acima. Após o estímulo as células foram analisadas por citometria de fluxo para a expressão das moléculas MHC de classe II e CD86, e a produção de IL -12, IL -23, IL -6 e IL -10 foi analisada nos sobrenadantes por ELISA. Para avaliar os mecanismos moleculares envolvidos na sinalização do receptor ?2 - adrenérgico durante a ativação das células dendríticas com LPS nós avaliamos a expressão gênica de Il12a, Il12b e Il23a por qPCR, assim como, analisamos por western-blotting as vias de sinalização de NF-?B e AP-1 nas células dendríticas tratadas ou não com o agonista do receptor ?2 - adrenérgico e ativadas com LPS. Finalmente, células T CD4+ naive purificadas por citometria de fluxo foram cocultivadas com células dendríticas imaturas e ativadas com LPS tratadas ou não com o agonista do receptor ?2 - adrenérgico na presença do anticorpo solúvel anti-CD3. Após 3 e 5 dias, a proliferação das células T CD4+ foi analisada por citometria de fluxo e a produção das citocinas IFN -? e IL -17A foi analisada por ELISA.
Apesar de já bem estabelecido que sinalização da noradrenalina via o receptor ?2 -adrenérgico inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias e aumenta a produção de IL -10 pelas células dendríticas ativadas com LPS, ainda não há estudos conclusivos mostran do se essa mudança no perfil de citocinas produzidas pelas células dendríticas pode ter um efeito na resposta imune adaptativa, do ponto de vista da diferenciação dos subtipos de células T CD4 +. Durante a ativação e diferenciação das células T CD4 + as cito cinas produzidas pelas células dendríticas influenciam na polarização dos diferentes subtipos de células T helper, sendo a IL -12p70 e a IL -23 importantes para a diferenciação de células Th1 e Th17, respectivamente. Objetivo: Avaliar o efeito da sinalização pelo receptor ?2 -adrenérgico na produção de IL -12p70 e IL -23 pelas células dendríticas ativadas com LPS, os mecanismos moleculares envolvidos e suas consequências na resposta imune adquirida. Métodos: Células dendríticas de camundongos C57BL6, IL-10 - / - e ?-arrestina 2 - / - foram geradas a partir de cultura de células da medula óssea com GM-CSF. No 9° dia de cultura, as células dendríticas imaturas foram tratadas ou não com agonista do receptor ?2 -adrenérgico por 1 hora e estimuladas com LPS por 18 horas. Em alguns exp erimentos, as células foram pré -tratadas com inibidor de PKA ou com antagonistas dos receptores ?2- e ?2 -adrenérgicos por 15 minutos e estimuladas como descrito acima. Após o estímulo as células foram analisadas por citometria de fluxo para a expressão das moléculas MHC de classe II e CD86, e a produção de IL -12, IL -23, IL -6 e IL -10 foi analisada nos sobrenadantes por ELISA. Para avaliar os mecanismos moleculares envolvidos na sinalização do receptor ?2 - adrenérgico durante a ativação das células dendríticas com LPS nós avaliamos a expressão gênica de Il12a, Il12b e Il23a por qPCR, assim como, analisamos por western-blotting as vias de sinalização de NF-?B e AP-1 nas células dendríticas tratadas ou não com o agonista do receptor ?2 - adrenérgico e ativadas com LPS. Finalmente, células T CD4+ naive purificadas por citometria de fluxo foram cocultivadas com células dendríticas imaturas e ativadas com LPS tratadas ou não com o agonista do receptor ?2 - adrenérgico na presença do anticorpo solúvel anti-CD3. Após 3 e 5 dias, a proliferação das células T CD4+ foi analisada por citometria de fluxo e a produção das citocinas IFN -? e IL -17A foi analisada por ELISA.
Descrição
Citação
TAKENAKA, Maisa Carla Silveira. O efeito da sinalização via o receptor beta 2 adrenérgico no perfil de citocinas produzidas pelas células dendríticas: impacto na diferenciação de células t cd4 +. 2014. 91 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.