Papel da acetilação proteica nos mecanismos de resposta ao estresse oxidativo de Trypanosoma cruzi
Data
2020-04-30
Autores
Moura, Leila Maria Dos Santos 
Orientadores
Moretti, Nilmar Silvio
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease, faces a redox environment during its life cycle in both invertebrate and vertebrate hosts. To deal with this environment the parasite has a complex antioxidant arsenal of enzymes that relies mainly in the use of trypanothione to eliminates reactive oxygen species. Eukaryotic cells have signaling pathways regulated by post-translational modifications that allows the activation/inhibition of antioxidant enzymes, which contributes to the maintenance of intracellular homeostasis of redox environment. The regulation of human manganese superoxide dismutase (MnSOD) by acetylation is a classic example of this mechanism of regulation. MnSOD is a key enzyme in the oxidative stress response converting superoxide molecules (O2-) to hydrogen peroxide (H2O2) and molecular oxygen, and is negatively regulated by acetylation. Recently, we described the acetylome of T. cruzi epimastigote form and detected the main antioxidant enzymes of this parasite acetylated, including the mitochondrial superoxide dismutase A (TcSODA), suggesting that protein acetylation could participate in the oxidative stress response of T. cruzi. Thus, in this project we decided to investigate the role of protein acetylation in the regulation of oxidative stress response in this parasite using as model of study TcSODA. Using site-directed mutations, we characterize the lysine residue K97 responsible for regulating the activity of TcSODA; demonstrated that cell lines overexpressing the mitochondrial lysine deacetylase NAD+-dependent, TcSir2rp3, are more resistance to oxidizing agents, H2O2 and menadione. Moreover, these cell lines presented higher resistance to benznidazole (BZD) and nifurtimox (NFX), the drugs used to treatment of Chagas disease, which is preconized to kill the parasite by increasing the levels of redox molecules in the cell. This resistance to BZD and NFX is accompanied by a reduction in ROS and an increase in the activity of superoxide dismutase of these parasites. Finally, we demonstrated the interaction of TcSODA and TcSir2rp3 proteins using immunoprecipitation assays. Taken together, these results shown for the first time the involvement of protein acetylation in the maintenance of homeostatic redox state in trypanosomatids, contributing to the understanding of mechanisms used by T. cruzi to progress during the infection and opening the opportunity to explore protein acetylation as potential drug target in this parasite.
Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, para progredir durante o curso da infecção precisa lidar com o ambiente redox encontrado tanto nos hospedeiros invertebrados quanto nos vertebrados. Para lidar com esse ambiente, o parasita possui um complexo arsenal de enzimas antioxidan tes, que se baseia principalmente no uso da molécula de tripanotiona para eliminação das espécies reativas de oxigênio. As células eucarióticas possuem vias de sinalização reguladas por modificações pós-traducionais que permitem a ativação/inibição de enzimas antioxidantes, o que contribui para a manutenção da homeostasia intracelular do ambiente redox. A regulação da enzima manganês superóxido dismutase de humanos (MnSOD) por acetilação, é um exemplo clássico desse tipo de mecanismo de regulação. A MnSOD é uma enzima chave na resposta ao estresse oxidativo, convertendo moléculas de superóxido (O2-) em peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio molecular, e é regulada negativamente pela acetilação. Recentemente, descrevemos o acetiloma da forma epimastigota de T. cruzi, e detectamos as principais enzimas antioxidantes desse parasita acetiladas, incluindo a superóxido dismutase A (TcSODA) mitocondrial, suge rindo que a acetilação proteica poderia participar na regulação da resposta ao estresse oxidativo no T cruzi. Assim, neste projeto, decidimos investigar o papel da acetilação de proteínas na regulação da resposta ao estresse oxidativo nesse parasita usando como modelo de estudo a TcSODA. Utilizando a metodologia de mutações sítio-dirigidas, caracterizamos o resíduo de lisina K97 como responsável por regular a atividade de TcSODA; demonstramos que linhagens celulares que superexpressam a lisina desacetilase mitocondrial dependente de NAD+ , TcSir2rp3, são mais resistentes aos agentes oxidantes H2O2 e Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, para progredir durante o curso da infecção precisa lidar com o ambiente redox encontrado tanto nos hospedeiros invertebrados quanto nos vertebrados. Para lidar com esse ambiente, o parasita possui um complexo arsenal de enzimas antioxidantes, que se baseia principalmente no uso da molécula de tripanotiona para eliminação das espécies reativas de oxigênio. As células eucarióticas possuem vias de sinalização reguladas por modificações pós-traducionais que permitem a ativação/inibição de enzimas antioxidantes, o que contribui para a manutenção da homeostasia intracelular do ambiente redox. A regulação da enzima manganês superóxido dismutase de humanos (MnSOD) por acetilação, é um exemplo clássico desse tipo de mecanismo de regulação. A MnSOD é uma enzima chave na resposta ao estresse oxidativo, convertendo moléculas de superóxido (O2-) em peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio molecular, e é regulada negativamente pela acetilação. Recentemente, descrevemos o acetiloma da forma epimastigota de T. cruzi, e detectamos as principais enzimas antioxidantes desse parasita acetiladas, incluindo a superóxido dismutase A (TcSODA) mitocondrial, sugerindo que a acetilação proteica poderia participar na regulação da resposta ao estresse oxidativo no T cruzi. Assim, neste projeto, decidimos investigar o papel da acetilação de proteínas na regulação da resposta ao estresse oxidativo nesse parasita usando como modelo de estudo a TcSODA. Utilizando a metodologia de mutações sítio-dirigidas, caracterizamos o resíduo de lisina K97 como responsável por regular a atividade de TcSODA; demonstramos que linhagens celulares que superexpressam a lisina desacetilase mitocondrial dependente de NAD+, TcSir2rp3, são mais resistentes aos agentes oxidantes H2O2 e Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, para progredir durante o curso da infecção precisa lidar com o ambiente redox encontrado tanto nos hospedeiros invertebrados quanto nos vertebrados. Para lidar com esse ambiente, o parasita possui um complexo arsenal de enzimas antioxidantes, que se baseia principalmente no uso da molécula de tripanotiona para eliminação das espécies reativas de oxigênio. As células eucarióticas possuem vias de sinalização reguladas por modificações pós-traducionais que permitem a ati vação/inibição de enzimas antioxidantes, o que contribui para a manutenção da homeostasia intracelular do ambiente redox. A regulação da enzima manganês superóxido dismutase de humanos (MnSOD) por acetilação, é um exemplo clássico desse tipo de mecanismo de regulação. A MnSOD é uma enzima chave na resposta ao estresse oxidativo, convertendo moléculas de superóxido (O2-) em peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio molecular, e é regulada negativamente pela acetilação. Recentemente, descrevemos o acetiloma da forma epimastigota de T. cruzi, e detectamos as principais enzimas antioxidantes desse parasita acetiladas, incluindo a superóxido dismutase A (TcSODA) mitocondrial, sugerindo que a acetilação proteica poderia participar na regulação da resposta ao estresse oxidativo no T cruzi. Assim, neste projeto, decidimos investigar o papel da acetilação de proteínas na regulação da resposta ao estresse oxidativo nesse parasita usando como modelo de estudo a TcSODA. Utilizando a metodologia de mutações sítio-dirigidas, caracterizamos o resíduo de lisina K97 como responsável por regular a atividade de TcSODA; demonstramos que linhagens celulares que superexpressam a lisina desacetilase mitocondrial dependente de NAD+, TcSir2rp3, são mais resistentes aos agentes oxidantes H2O2 e menadiona. Além disso, verificamos que essas linhagens celulares apresentaram maior resistência ao benznidazol (BZD) e nifurtimox (NFX), fármacos utiliza dos no tratamento da doença de Chagas, preconizados como compostos que aumentam o os níveis de moléculas redox no parasito, o que pode levar a morte celular. Essa resistência ao BZD e NFX é acompanhada por uma redução nos níveis de ROS e um aumento na atividade da superóxido dismutase nestes parasitas superexpressores. Finalmente, demonstramos a interação das proteínas TcSODA e TcSir2rp3 através de imunoprecipitação de proteínas. Em conjunto, esses resultados mostram pela primeira vez o envolvimento da acetilação de proteínas na manutenção do estado redox em tripanossomatídeos, contribuindo para melhor entendimento dos mecanismos utilizados pelo T. cruzi para progredir durante a infecção, e abrindo a possibilidade de explorar acetilação como potencial alvo de drogas neste parasito.
Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, para progredir durante o curso da infecção precisa lidar com o ambiente redox encontrado tanto nos hospedeiros invertebrados quanto nos vertebrados. Para lidar com esse ambiente, o parasita possui um complexo arsenal de enzimas antioxidan tes, que se baseia principalmente no uso da molécula de tripanotiona para eliminação das espécies reativas de oxigênio. As células eucarióticas possuem vias de sinalização reguladas por modificações pós-traducionais que permitem a ativação/inibição de enzimas antioxidantes, o que contribui para a manutenção da homeostasia intracelular do ambiente redox. A regulação da enzima manganês superóxido dismutase de humanos (MnSOD) por acetilação, é um exemplo clássico desse tipo de mecanismo de regulação. A MnSOD é uma enzima chave na resposta ao estresse oxidativo, convertendo moléculas de superóxido (O2-) em peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio molecular, e é regulada negativamente pela acetilação. Recentemente, descrevemos o acetiloma da forma epimastigota de T. cruzi, e detectamos as principais enzimas antioxidantes desse parasita acetiladas, incluindo a superóxido dismutase A (TcSODA) mitocondrial, suge rindo que a acetilação proteica poderia participar na regulação da resposta ao estresse oxidativo no T cruzi. Assim, neste projeto, decidimos investigar o papel da acetilação de proteínas na regulação da resposta ao estresse oxidativo nesse parasita usando como modelo de estudo a TcSODA. Utilizando a metodologia de mutações sítio-dirigidas, caracterizamos o resíduo de lisina K97 como responsável por regular a atividade de TcSODA; demonstramos que linhagens celulares que superexpressam a lisina desacetilase mitocondrial dependente de NAD+ , TcSir2rp3, são mais resistentes aos agentes oxidantes H2O2 e Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, para progredir durante o curso da infecção precisa lidar com o ambiente redox encontrado tanto nos hospedeiros invertebrados quanto nos vertebrados. Para lidar com esse ambiente, o parasita possui um complexo arsenal de enzimas antioxidantes, que se baseia principalmente no uso da molécula de tripanotiona para eliminação das espécies reativas de oxigênio. As células eucarióticas possuem vias de sinalização reguladas por modificações pós-traducionais que permitem a ativação/inibição de enzimas antioxidantes, o que contribui para a manutenção da homeostasia intracelular do ambiente redox. A regulação da enzima manganês superóxido dismutase de humanos (MnSOD) por acetilação, é um exemplo clássico desse tipo de mecanismo de regulação. A MnSOD é uma enzima chave na resposta ao estresse oxidativo, convertendo moléculas de superóxido (O2-) em peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio molecular, e é regulada negativamente pela acetilação. Recentemente, descrevemos o acetiloma da forma epimastigota de T. cruzi, e detectamos as principais enzimas antioxidantes desse parasita acetiladas, incluindo a superóxido dismutase A (TcSODA) mitocondrial, sugerindo que a acetilação proteica poderia participar na regulação da resposta ao estresse oxidativo no T cruzi. Assim, neste projeto, decidimos investigar o papel da acetilação de proteínas na regulação da resposta ao estresse oxidativo nesse parasita usando como modelo de estudo a TcSODA. Utilizando a metodologia de mutações sítio-dirigidas, caracterizamos o resíduo de lisina K97 como responsável por regular a atividade de TcSODA; demonstramos que linhagens celulares que superexpressam a lisina desacetilase mitocondrial dependente de NAD+, TcSir2rp3, são mais resistentes aos agentes oxidantes H2O2 e Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, para progredir durante o curso da infecção precisa lidar com o ambiente redox encontrado tanto nos hospedeiros invertebrados quanto nos vertebrados. Para lidar com esse ambiente, o parasita possui um complexo arsenal de enzimas antioxidantes, que se baseia principalmente no uso da molécula de tripanotiona para eliminação das espécies reativas de oxigênio. As células eucarióticas possuem vias de sinalização reguladas por modificações pós-traducionais que permitem a ati vação/inibição de enzimas antioxidantes, o que contribui para a manutenção da homeostasia intracelular do ambiente redox. A regulação da enzima manganês superóxido dismutase de humanos (MnSOD) por acetilação, é um exemplo clássico desse tipo de mecanismo de regulação. A MnSOD é uma enzima chave na resposta ao estresse oxidativo, convertendo moléculas de superóxido (O2-) em peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio molecular, e é regulada negativamente pela acetilação. Recentemente, descrevemos o acetiloma da forma epimastigota de T. cruzi, e detectamos as principais enzimas antioxidantes desse parasita acetiladas, incluindo a superóxido dismutase A (TcSODA) mitocondrial, sugerindo que a acetilação proteica poderia participar na regulação da resposta ao estresse oxidativo no T cruzi. Assim, neste projeto, decidimos investigar o papel da acetilação de proteínas na regulação da resposta ao estresse oxidativo nesse parasita usando como modelo de estudo a TcSODA. Utilizando a metodologia de mutações sítio-dirigidas, caracterizamos o resíduo de lisina K97 como responsável por regular a atividade de TcSODA; demonstramos que linhagens celulares que superexpressam a lisina desacetilase mitocondrial dependente de NAD+, TcSir2rp3, são mais resistentes aos agentes oxidantes H2O2 e menadiona. Além disso, verificamos que essas linhagens celulares apresentaram maior resistência ao benznidazol (BZD) e nifurtimox (NFX), fármacos utiliza dos no tratamento da doença de Chagas, preconizados como compostos que aumentam o os níveis de moléculas redox no parasito, o que pode levar a morte celular. Essa resistência ao BZD e NFX é acompanhada por uma redução nos níveis de ROS e um aumento na atividade da superóxido dismutase nestes parasitas superexpressores. Finalmente, demonstramos a interação das proteínas TcSODA e TcSir2rp3 através de imunoprecipitação de proteínas. Em conjunto, esses resultados mostram pela primeira vez o envolvimento da acetilação de proteínas na manutenção do estado redox em tripanossomatídeos, contribuindo para melhor entendimento dos mecanismos utilizados pelo T. cruzi para progredir durante a infecção, e abrindo a possibilidade de explorar acetilação como potencial alvo de drogas neste parasito.