Solubilização de membranas modelo de diferentes composições pelo detergente triton X-100
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Data
2017-03-29
Autores
Mattei, Bruno 
Orientadores
Riske, Karin do Amaral
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Detergents are amphiphilic molecules widely used as solubilizing agents Biological membranes. However, biological membranes treated with detergents Ac-ese insoluble fragments rich in sphingolipids and cholesterol. Due to similarities of These features have been associated with lipid rafts and the liquid phase The. Here the study of the physical-chemical aspects that govern the process of UUilllCATiOn of membrane mimetic models: lipid vesicles of controlled composition Pure or mixtures, mainly POPC, SM and cholesterol). Many different Techniques were used to study the solubilization process of lipid vesicles by Detergent TX-100, one of the most used detergents in Biological membranes. The general phenomenon and the size of the structures formed during the Solubilization was obtained by turbidity, static and / or dynamic light scattering; The aspects Thermodynamic properties of the detergent-lipid interaction were investigated by titration calorimetry And the possible interference of the detergent in the phase transition of lipids was investigated Differential scanning calorimetry; The ability of detergents to permeabilize the The membrane was investigated by kinetics of leakage of a fluorescent probe and microscopy Confocal; The process of solubilization of giant vesicles was evaluated by optical microscopy of Phase contrast and fluorescence. In the work, different lipid compositions were investigated (Pure phospholipids, binary lipid mixtures and ternary lipid mixtures) in order to obtain Information on the factors that influence the obtaining of insoluble membrane fragments. Through the experiments it was possible to conclude that pure cell membranes (POPC and SM), reaching the liquid-disordered phase and gel are totally soluble to the action of Detergent, whereas the addition of cholesterol, inducing a higher degree of Lipids leads to conditions in which the membranes are partially or totally insoluble; The factor of Insolubility is conditioned to cholesterol concentration in vesicles with binary mixtures Of lipids, reaching total insolubility in situations in which the membrane tends or reaches the Liquid-ordered phase; This is also reflected in the detergent affinity constant for these Membranes. In addition, vesicles in the gel phase are solubilized with lower concentrations of TX-100 than vesicles in the liquid-disordered phase, possibly due to the lower Ability of the membrane to accommodate detergents; Added to this, the addition of detergent Also appears to induce a phase transition in vesicles in the gel phase and a coexistence of Fluid phases in POPC: cholesterol vesicles. In ternary lipid mixtures, the situations in Higher solubility resistance is observed in regions with Greater fraction of SM and cotesterol. Finally, the membranes become permeable in TX-100 / lipid molars lower than the solubilization process, showing that even before To reach the bi-co-existent phase of the membrane, the detergent already changes the membrane structure.
Detergentes são moléculas anfifílicas amplamente utilizadas como agentes solubilizantes membranas biológicas. No entanto, membranas biológicas tratadas com detergentes ac-ese fragmentos insolúveis ricos em esfingolipídios e colesterol. Devido a semelhanças de ,.....r.n,.posíção e característica, esses fragmentos têm sido associados aos lipid rafts e à fase líquidoa a. Aqui foi realizado o estudo de aspectos físico-químicos que regem o processo de UUilllLClçãOde modelos miméticos da membrana: vesículas lipídicas de composição controlada puros ou misturas, principalmente dos lipídios POPC, SM e colesterol). Diferentes écnicas foram utilizadas para estudar o processo de solubilização de vesículas lipídicas pelo detergente TX-100, um dos detergentes mais empregados em protocolos de solubilização de membranas biológicas. O fenômeno geral e o tamanho das estruturas formadas durante a solubilização foi obtido por turbidez, espalhamento de luz estático e/ou dinâmico; os aspectos termodinâmicos da interação detergente-lipídio foram investigados por calorimetria de titulação isotérmica e a possível interferência do detergente na transição de fase dos lipídios foi investigada por calorimetrta diferencial de varredura; a capacidade dos detergentes de permeabilizar a membrana foi investigada por cinética de vazamento de uma sonda fluorescente e microscopia confocal; o processo de solubilização de vesículas gigantes foi avaliado por microscopia óptica de contraste de fase e fluorescência. No trabalho foram investigadas diferentes composições lipídicas (fosfolipídios puros, misturas lipídicas binárias e misturas lipídicas ternárias) a fim de obter informações sobre os fatores que influenciam a obtenção de fragmentos insolúveis de membrana. Por meio dos experimentos realizados foi possível concluir que membranas celostoüpldíos puros (POPC e SM), atingindo a fase líquido-desordenada e gel são totalmente solúveis à ação do detergente, enquanto que a adição de colesterol, induzindo um maior grau de ordenamento dos lipídios leva a condições nas quais as membranas são parcial ou totalmente insolúveis; o fator de insolubilidade está condicionado à concentração de colesterol em vesículas com misturas binárias de lipídios, atingindo a total insolubilidade em situações nas quais a membrana tende ou atinge a fase líquido-ordenada; isto também se reflete na constante de afinidade do detergente por essas membranas. Além disso, vesículas na fase gel são solubilizadas com menores concentrações de TX-100 do que vesículas na fase líquido-desordenada, possivelmente em decorrência na menor capacidade da membrana de acomodar os detergentes; somado a isso, a adição do detergente também parece induzir uma transição de fases em vesículas na fase gel e uma coexistência de fases fluidas em vesículas de POPC:colesterol. Em misturas ternárias de lipídios, as situações nas quais é possível observar uma maior resistência à solubilização é observada em regiões com maior fração de SM e cotesterol. Por fim, as membranas tomam-se permeáveis em razões molares TX-100/lipídio inferiores ao processo de solubilização, mostrando que mesmo antes de atingir a fase de coexistência bicarnada-rnicela o detergente já
Detergentes são moléculas anfifílicas amplamente utilizadas como agentes solubilizantes membranas biológicas. No entanto, membranas biológicas tratadas com detergentes ac-ese fragmentos insolúveis ricos em esfingolipídios e colesterol. Devido a semelhanças de ,.....r.n,.posíção e característica, esses fragmentos têm sido associados aos lipid rafts e à fase líquidoa a. Aqui foi realizado o estudo de aspectos físico-químicos que regem o processo de UUilllLClçãOde modelos miméticos da membrana: vesículas lipídicas de composição controlada puros ou misturas, principalmente dos lipídios POPC, SM e colesterol). Diferentes écnicas foram utilizadas para estudar o processo de solubilização de vesículas lipídicas pelo detergente TX-100, um dos detergentes mais empregados em protocolos de solubilização de membranas biológicas. O fenômeno geral e o tamanho das estruturas formadas durante a solubilização foi obtido por turbidez, espalhamento de luz estático e/ou dinâmico; os aspectos termodinâmicos da interação detergente-lipídio foram investigados por calorimetria de titulação isotérmica e a possível interferência do detergente na transição de fase dos lipídios foi investigada por calorimetrta diferencial de varredura; a capacidade dos detergentes de permeabilizar a membrana foi investigada por cinética de vazamento de uma sonda fluorescente e microscopia confocal; o processo de solubilização de vesículas gigantes foi avaliado por microscopia óptica de contraste de fase e fluorescência. No trabalho foram investigadas diferentes composições lipídicas (fosfolipídios puros, misturas lipídicas binárias e misturas lipídicas ternárias) a fim de obter informações sobre os fatores que influenciam a obtenção de fragmentos insolúveis de membrana. Por meio dos experimentos realizados foi possível concluir que membranas celostoüpldíos puros (POPC e SM), atingindo a fase líquido-desordenada e gel são totalmente solúveis à ação do detergente, enquanto que a adição de colesterol, induzindo um maior grau de ordenamento dos lipídios leva a condições nas quais as membranas são parcial ou totalmente insolúveis; o fator de insolubilidade está condicionado à concentração de colesterol em vesículas com misturas binárias de lipídios, atingindo a total insolubilidade em situações nas quais a membrana tende ou atinge a fase líquido-ordenada; isto também se reflete na constante de afinidade do detergente por essas membranas. Além disso, vesículas na fase gel são solubilizadas com menores concentrações de TX-100 do que vesículas na fase líquido-desordenada, possivelmente em decorrência na menor capacidade da membrana de acomodar os detergentes; somado a isso, a adição do detergente também parece induzir uma transição de fases em vesículas na fase gel e uma coexistência de fases fluidas em vesículas de POPC:colesterol. Em misturas ternárias de lipídios, as situações nas quais é possível observar uma maior resistência à solubilização é observada em regiões com maior fração de SM e cotesterol. Por fim, as membranas tomam-se permeáveis em razões molares TX-100/lipídio inferiores ao processo de solubilização, mostrando que mesmo antes de atingir a fase de coexistência bicarnada-rnicela o detergente já