Caracterização molecular dos mecanismos de resistência às polimixinas em isolados clínicos multirresistentes de acinetobacter baumannii provenientes de hospitais brasileiros

Página do item simplificado
dc.contributor.advisorGales, Ana Cristina [UNIFESP]
dc.contributor.advisor-coSilva, Rodrigo Cayô da [UNIFESP]
dc.contributor.advisor-coLatteshttp://lattes.cnpq.br/5699739668358897pt_BR
dc.contributor.advisorLatteshttp://lattes.cnpq.br/8402272715765172pt_BR
dc.contributor.authorNodari, Carolina Silva [UNIFESP]
dc.contributor.authorLatteshttp://lattes.cnpq.br/5028397030700989pt_BR
dc.coverage.spatialUniversidade Federal de São Paulopt_BR
dc.date.accessioned2021-12-22T13:26:00Z
dc.date.available2021-12-22T13:26:00Z
dc.date.issued2020-05-28
dc.description.abstractO objetivo deste trabalho foi caracterizar isolados clínicos de A. baumannii resistentes às polimixinas provenientes de diferentes hospitais brasileiros. A identificação dos isolados em nível de espécie foi realizada através do sequenciamento do gene rpoB e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado por microdiluição em caldo. Os isolados foram submetidos a sequenciamento do genoma completo utilizando a plataforma Illumina e a similaridade genética entre eles foi determinada por ApaI-PFGE, MLST e cgMSLT. A presença de genes que codificam carbapenemases, metilases e de genes qnr foi triada por PCR. A análise do sequenciamento genômico foi utilizada para determinar as variantes de β-lactamases e enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs) presentes nos isolados, bem como identificar outros genes adquiridos de resistência aos antimicrobianos e verificar o contexto genético em que estavam inseridos. As sequências proteicas do sistema de efluxo AdeABC e das principais proteínas de membrana externa (OMPs) de A. baumannii também foram avaliadas. As sequências dos genes lpxACD e pmrAB foram comparadas entre isolados sensíveis e resistentes às polimixinas para a pesquisa de mutações com provável função neste fenótipo e suas expressões relativas foram determinadas por qRT-PCR. Inicialmente, 15 isolados com fenótipo sugestivo de resistência às polimixinas provenientes de cinco instituições brasileiras foram incluídos no estudo. Posteriormente, sete isolados sensíveis a estes antibióticos foram incluídos para comparação. Todos foram identificados como A. baumannii e foram classificados em seis grupos clonais por PFGE, pertencentes aos complexos clonais 1 (n=1), 15 (n=4), 25 (n=3) e 79 (n=14). A resistência às polimixinas foi confirmada nos 15 isolados. Além disso, todos os isolados foram resistentes aos carbapenêmicos e à ciprofloxacina e a grande maioria apresentou elevados valores de CIM para as cefalosporinas, para a amicacina e para a tigeciclina. Já as atividades in vitro da gentamicina e da ampicilina/sulbactam variaram entre as amostras testadas. O antimicrobiano mais ativo contra estes micro-organismos foi a minociclina. Os isolados incluídos no estudo apresentaram uma diversidade de variantes de blaOXA-51, compatíveis com os clones a que pertenciam, sendo a OXA-65 a mais frequente. Além disso, todos os isolados produziam uma CHDL adquirida, podendo ser OXA-23 e/ou OXA-72, sendo que a sequência de inserção ISAba1 foi detectada à montante de blaOXA-23 em todos os isolados. Não foram detectadas outras carbapenemases, nem metilases ou genes qnr. Por outro lado, foi encontrada uma diversidade de AMEs e de genes de resistência a outras classes de antimicrobianos, bem como mutações em gyrA e parC associadas à resistência às fluoroquinolonas. Também foram identificadas mutações não-sinônimas no sistema de efluxo AdeABC e na maioria das OMPs. A expressão do operon lpxACD estava levemente reduzida tanto nos isolados resistentes quanto nos sensíveis e só foram encontradas substituições de aminoácidos em LpxD. Essas substituições, no entanto, foram encontradas em isolados com diferentes perfis de sensibilidade às polimixinas e os padrões de substituição encontrados foram característicos de cada complexo clonal, tratando-se, portanto, de polimorfismos. Por outro lado, grande parte dos isolados apresentou aumento na expressão de pmrAB e uma diversidade de mutações nos genes pmrA e pmrB, incluindo duplicações. Algumas dessas mutações foram consideradas polimorfismos naturais característicos de cada grupo clonal, enquanto outras foram identificadas apenas em isolados resistentes. Não foi possível identificar mutações em PmrAB presentes apenas em isolados resistentes às polimixinas do CC15. Além disso, o operon pmrAB dos isolados pertencentes ao CC25 parece ter sido proveniente de outros complexos clonais e ter sido transferido por recombinação homóloga. Nos isolados pertencentes ao CC79 ainda foi identificado um gene adicional que codifica uma fosfoetanolamina transferase e, em pelo menos um dos isolados, este gene apresentou mutações não sinônimas. Conclui-se, portanto, que os mecanismos moleculares de resistência às polimixinas variaram e devem ser determinados de forma individualizada para cada isolado. Estudos adicionais são necessários para verificar a presença de mecanismos desconhecidos de resistência às polimixinas, especialmente no CC15.pt_BR
dc.description.abstractThe aim of this study was to characterize polymyxin-resistant A. baumannii clinical isolates from distinct Brazilian hospitals. The identification of isolates at the species level was performed by rpoB gene sequencing and antimicrobial susceptibility profile was determined by broth microdilution. Isolates were submitted to whole genome sequencing using Illumina platform and genetic similarity between them was determined by ApaI-PFGE, MLST and cgMLST. The presence of carbapenemase encoding genes, methylases and qnr genes was screened by PCR. Genome sequencing analysis was used to determine the β-lactamases and aminoglycosidemodifying enzymes (AMEs) variants present in the isolates, as well as to identify other acquired resistance determinants and to verify the genetic context in which they were inserted. The protein sequences of the AdeABC efflux system and the most relevant A. baumannii outer membrane proteins (OMPs) were also evaluated. The lpxACD and pmrAB sequences were compared between polymyxin-susceptible and -resistant isolates to identify mutations with a possible role in this phenotype and their relative expressions were determined by qRT-PCR. A total of 22 isolates from five Brazilian institutions were included in the study. Among them, 15 were previously considered to be resistant to polymyxins. Additionally, seven polymyxin-susceptible isolates were included for comparison. Every isolate was identified as A. baumannii. These isolates were sorted into six clonal groups by PFGE, which belonged to clonal complexes (CC) 1 (n=1), 15 (n=4), 25 (n=3) and 79 (n=14). Among the isolates, 15 were confirmed to be resistant to polymyxins. In addition, all isolates were resistant to carbapenems and ciprofloxacin and the vast majority showed high MIC values to cephalosporins, amikacin and tigecycline. The in vitro activities of gentamicin and ampicillin/sulbactam varied among the isolates and minocycline was the most active antimicrobial agent evaluated. The isolates showed a diversity of blaOXA-51 variants, compatible with the CC to which they belonged, and OXA-65 was the most frequent one detected. In addition, all isolates produced an acquired CHDL, which were OXA-23 and/or OXA72, and the ISAba1 insertion sequence was detected upstream of blaOXA-23 in all isolates. No other carbapenemases, methylases or qnr genes was detected. On the other hand, a diversity of AMEs and resistance determinants to other classes of antimicrobials were found, as well as mutations in gyrA and parC associated with fluoroquinolone resistance. Non-synonymous mutations have also been identified in the AdeABC efflux system and in most OMPs. The expression of the lpxACD operon was slightly reduced in both resistant and susceptible isolates and amino acid substitutions were found only in LpxD. These substitutions, however, were found in isolates with different susceptibility profiles to polymyxins and the substitution patterns were characteristic of each clonal complex, being considered, therefore, natural polymorphisms. On the other hand, most isolates showed an increased expression of pmrAB and a diversity of mutations was observed in the pmrA and pmrB genes, including duplications. Some of these mutations were considered natural polymorphisms characteristic of each clonal group, while others were identified only in resistant isolates. It was not possible to identify mutations in PmrAB present only in polymyxin-resistant isolates belonging to CC15. In addition, pmrAB operon of the isolates belonging to CC25 appears to have come from other clonal complexes and was transferred by homologous recombination. In the isolates belonging to CC79, an additional gene encoding for a phosphoethanolamine transferase was also identified and, in at least one of the isolates, this gene showed non-synonymous mutations. In conclusion, molecular mechanisms of polymyxin resistance must be determined individually for each isolate. Additional studies are necessary to verify the presence of unknown mechanisms of polymyxin resistance, especially in CC15.en
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)pt_BR
dc.format.extent165 f.pt_BR
dc.identifierhttps://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=9207798
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/11600/62463
dc.languageporpt_BR
dc.publisherUniversidade Federal de São Paulopt_BR
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/restrictedAccesspt_BR
dc.subjectCHDLpt_BR
dc.subjectEpidemiologiapt_BR
dc.subjectLipídio Apt_BR
dc.subjectsistema de dois componentespt_BR
dc.titleCaracterização molecular dos mecanismos de resistência às polimixinas em isolados clínicos multirresistentes de acinetobacter baumannii provenientes de hospitais brasileirospt_BR
dc.title.alternativeMolecular characterization of polymyxin resistance mechanisms in multidrug-resistant acinetobacter baumannii clinical isolates from brazilian hospitalsen
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesispt_BR
unifesp.campusEscola Paulista de Medicina (EPM)pt_BR
unifesp.graduateProgramMedicina Translacionalpt_BR
Arquivos
Pacote Original
Agora exibindo 1 - 1 de 1
Imagem de Miniatura
Nome:
Tese - versão final - Carolina Silva Nodari.pdf
Tamanho:
1.75 MB
Formato:
Adobe Portable Document Format
Descrição:
Baixar
Licença do Pacote
Agora exibindo 1 - 1 de 1
Imagem de Miniatura
Nome:
license.txt
Tamanho:
5.81 KB
Formato:
Item-specific license agreed upon to submission
Descrição:
Baixar
Coleções
PPG - Medicina Translacional