Caracterização molecular da formação de biofilme por Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) O119
Data
2019-02-28
Autores
Flores, Maricelia Navarro Pinheiro 
Orientadores
Scaletsky, Isabel Cristina Affonso
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
EPEC can be categorized into two subgroups, typical (tEPEC) and atypical (aEPEC), based on the presence or absence of the EPEC adherence factor plasmid (pEAF), respectively. EPEC colonizes the proximal small intestine, where it adheres to epithelial cells forming microcolonies. Microcolony formation is one of the initial steps in biofilm development, but, very little is known regarding biofilm formation by EPEC strains. Our laboratory investigated the ability of biofilm formation in a collection of 223 EPEC strains (70 typical and 153 atypical) belonged to EPEC and non-EPEC serogroups. Biofilm formation occurred in 11/ tEPEC and 37 aEPEC strains from different serotypes. Typical EPEC formed biofilm on a polystyrene plate at 37C, whereas aEPEC strains formed at 26C in LB, or LBNS. The gene sequences related to type 1 fimbriae, curli, flagellin, antigen 43, and the autotransporter proteins of enterohemorrhagic E. coli EhaA, EhaB (ehaBa and ehaBb) and Cah were identified in most of the typical and atypical biofilm-producing strains. The objetive of this study was to continue the studies of our laboratory, identifying the genetic determinant involved in the biofilm formation of one tEPEC strain. We began the study by selecting the tEPEC strain between the group of the strains previously characterized as biofilm forming. Biofilm formation quantification results showed that three strains presented strong biofilm and seven strains presented moderate biofilm at 37ºC in LBNS medium. Among the 3 strains, T29 (O119: H6) strain was selected for presenting a robust biofilm on abiotic surface and a dense pellicle at the air-liquid interface. The T29 strain (O119: H6) was mutagenized with the transposon mini-Tn10, and four mutants (M6, M21, M160 and M175) were identified that lost the ability to form biofilm on polystyrene surface and pellicle at the liquid-air interface. The DNA flanked by the transposon insert was cloned into the plasmid vector pUC19, and the clones obtained were sequenced. BLASTN analysis of the 529 bp and 322 bp sequences obtained from the sequencing of clones M6.1 and M21.1, respectively, revealed homology with the enzyme aspartate ammonia lyase and fimD gene related to fimbriae type 1. Studies are in progress with mutants M160 and M175.
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é subdividida em típica (tEPEC) e atípica (aEPEC), tendo por base a presença ou ausência do plasmídio EAF (EPEC adherence factor), respectivamente. A adesão a células epiteliais formando microcolônias é uma característica marcante de EPEC, sendo uma das etapas iniciais no desenvolvimento de biofilmes. Em nosso laboratório, foi investigada a capacidade de formação de biofilme em uma coleção de 223 amostras de EPEC (70 típicas e 153 atípicas) pertencentes ou não aos sorogrupos clássicos de EPEC. A capacidade de aderir a superfície abiótica foi observada em 11 tEPEC e 37 EPEC, a maioria pertencente aos sorogrupos clássicos de EPEC, sendo O119 o mais frequente. Análise inicial de mutantes obtidos por mutagênese da amostra de aEPEC A111 (O119:HNT) identificou mutantes não formadores de biofilme apresentando inserção do transposon em genes da fímbria tipo I. Desta forma, este estudo teve como objetivo dar continuidade aos estudos de nosso laboratório, caracterizando os determinantes genéticos envolvidos na formação de biofilme de uma amostra de tEPEC. Esse estudo teve início com a escolha da amostra no grupo das tEPEC caracterizadas anteriormente como formadoras de biofilme. Os resultados dos ensaios de quantificação da formação de bioflme demonstraram que das 11 amostras, três amostras (T13, T29 e T31) apresentaram biofilme forte e oito amostras apresentaram biofilme moderado a 37ºC em meio Luria-Bertani sem sal. A amostra T29 (O119:H6) foi selecionada para o estudo genético por apresentar um biofilme mais forte em relação as amostras T13 e T31 e formar uma película densa na interface ar-líquido. A amostra T29 foi mutagenizada com o transposon mini-Tn10, sendo identificados 4 mutantes (M6, M21, M160 e M175) que perderam a capacidade de formar biofilme em superfície de poliestireno e película na interface líquido-ar. O DNA flanqueado pela inserção do transposon foi clonado no vetor plasmidial pUC19. A análise da sequência de 529 pb, obtida a partir do sequenciamento do clone M6.1 revelou homologia com a enzima aspartato amônia liase. A análise da sequência de 322 pb, obtida a partir do sequenciamento do clone M21.1 identificou o gene fimD relacionado a fímbria tipo 1 Estudos estão em andamento com os mutantes M160 e M175.
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é subdividida em típica (tEPEC) e atípica (aEPEC), tendo por base a presença ou ausência do plasmídio EAF (EPEC adherence factor), respectivamente. A adesão a células epiteliais formando microcolônias é uma característica marcante de EPEC, sendo uma das etapas iniciais no desenvolvimento de biofilmes. Em nosso laboratório, foi investigada a capacidade de formação de biofilme em uma coleção de 223 amostras de EPEC (70 típicas e 153 atípicas) pertencentes ou não aos sorogrupos clássicos de EPEC. A capacidade de aderir a superfície abiótica foi observada em 11 tEPEC e 37 EPEC, a maioria pertencente aos sorogrupos clássicos de EPEC, sendo O119 o mais frequente. Análise inicial de mutantes obtidos por mutagênese da amostra de aEPEC A111 (O119:HNT) identificou mutantes não formadores de biofilme apresentando inserção do transposon em genes da fímbria tipo I. Desta forma, este estudo teve como objetivo dar continuidade aos estudos de nosso laboratório, caracterizando os determinantes genéticos envolvidos na formação de biofilme de uma amostra de tEPEC. Esse estudo teve início com a escolha da amostra no grupo das tEPEC caracterizadas anteriormente como formadoras de biofilme. Os resultados dos ensaios de quantificação da formação de bioflme demonstraram que das 11 amostras, três amostras (T13, T29 e T31) apresentaram biofilme forte e oito amostras apresentaram biofilme moderado a 37ºC em meio Luria-Bertani sem sal. A amostra T29 (O119:H6) foi selecionada para o estudo genético por apresentar um biofilme mais forte em relação as amostras T13 e T31 e formar uma película densa na interface ar-líquido. A amostra T29 foi mutagenizada com o transposon mini-Tn10, sendo identificados 4 mutantes (M6, M21, M160 e M175) que perderam a capacidade de formar biofilme em superfície de poliestireno e película na interface líquido-ar. O DNA flanqueado pela inserção do transposon foi clonado no vetor plasmidial pUC19. A análise da sequência de 529 pb, obtida a partir do sequenciamento do clone M6.1 revelou homologia com a enzima aspartato amônia liase. A análise da sequência de 322 pb, obtida a partir do sequenciamento do clone M21.1 identificou o gene fimD relacionado a fímbria tipo 1 Estudos estão em andamento com os mutantes M160 e M175.