Estudo de cisteíno peptidases do inseto Diaphorina citri, vetor da doença dos citros Huanglongbing, e seleção de compostos oxadiazólicos como inibidores das catepsinas B, L e K

Data
2024-09-03
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
O Huanglongbing, doença mais devastadora da citricultura, é causado pela bactéria Candidatus Liberibacter e transmitido pelo inseto vetor Diaphorina citri. O combate ao vetor é feito com inseticidas, mas tem-se buscado outras formas de controle. Nos insetos, as cisteíno catepsinas são alvos importantes, pois atuam como enzimas digestivas, entre outras funções. Foram identificadas por proteoma do intestino do D. citri, oito catepsinas B e três catepsinas L. Dessas, nosso grupo já caracterizou uma catepsina B-like e uma L-like, altamente expressas no intestino de D. citri, sugerindo função digestiva. Estendemos esses estudos visando caracterizar duas outras catepsinas do inseto e buscar inibidores para as mesmas, o que poderá levar a estratégias para retardar o desenvolvimento e proliferação de D. citri. Em humanos, as cisteíno catepsinas, por possuírem uma variedade de atuações, tornam importante a busca por inibidores seletivos. Neste contexto e em busca de inibidores das catepsinas de D. citri, compostos sintéticos foram testados como inibidores das catepsinas humanas. Dessa forma, os objetivos desse trabalho foram a identificação, produção recombinante e caracterização de catepsinas B-like e L-like de Diaphorina citri, e teste de compostos oxadiazólicos como inibidores das catepsinas recombinantes humanas B, L e K. Foram realizadas análises in sílico das catepsinas de D. citri DccathL2 e DccathB3; ensaios de expressão em Pichia pastoris; expressão em E. coli; solubilização, purificação e refolding das proteínas; e expressão em E. coli dos mutantes DccathL2mut e DccathB3mut. Em relação aos estudos de inibição de atividade catalítica das catepsinas recombinantes humanas B, L e K, foram testados quatorze compostos dipeptídicos 2-amino-1,3,4-oxadiazóis e nitrilas, os valores de Ki foram calculados e foi definido o modo de inibição. Como resultados desse trabalho, duas sequências de proteínas de D. citri do tipo catepsinas B-like e L-like foram selecionadas para expressão em Pichia pastoris, mas não houve a expressão nesse sistema. Foi possível a expressão em células de E. coli, na fração insolúvel. Seguindo diferentes protocolos de solubilização e refolding, não foi possível obter as catepsinas cataliticamente ativas. Após nova análise in silico, observou-se que ambas catepsinas possuiam uma mutação no sítio ativo, que promoveu a substituição do resíduo de cisteína por um resíduo de serina. Foram sintetizados mutantes, substituindo a serina por cisteína, mas ainda assim não foi possível obter as catepsinas cataliticamente ativas. Paralelamente, visando desenvolver potenciais inibidores sintéticos para as cisteíno catepsinas de D. citri, foram determinadas as constantes de inibição (Ki) de quatorze compostos oxadiazólicos e nitrilas frente às catepsinas recombinantes humanas B, L e K. O derivado 2-amino-1,3,4-oxadiazol denominado 10e foi 90 vezes mais seletivo para a catepsina L em relação à catepsina B. Foi determinado o modo de inibição que mostrou ser competitivo. Como conclusões desse trabalho, duas pseudo catepsinas do tipo B-like e L-like foram identificadas, pela primeira vez em D. citri, contendo um resíduo de serina no lugar do resíduo de cisteína do sítio ativo. As proteínas expressas não apresentaram atividade catalítica. A versão mutante de DccathL2, onde uma cisteína foi colocada no lugar do resíduo de serina no sítio ativo, também não apresentou atividade catalítica. Considerando as diferentes funções das pseudoenzimas e das catepsinas funcionais de D. citri, inferimos que as pseudo catepsinas exercem funções auxiliares às catepsinas funcionais. Em relação ao estudo de inibição das catepsinas humanas B, L e K, os compostos oxadiazólicos foram melhores inibidores do que os compostos nitrilas, e alguns deles se destacaram pela eficiência de inibição e seletividade entre as diferentes catepsinas humanas por nós estudadas.
Huanglongbing, the most devastating disease in citrus farming, is caused by the bac-terium Candidatus Liberibacter and transmitted by the insect vector Diaphorina citri. The vector is controlled with insecticides, but other forms of control have been sought. In insects, cysteine cathepsins are important targets, as they act as digestive enzymes, among other functions. Eight cathepsins B and three cathepsins L were identified in the intestine proteome of D. citri. Of these, our group has already characterized a B-like and an L-like cathepsins, highly expressed in the intestine of D. citri, suggesting a digestive function. We extended these studies to characterize two other cathepsins of the insect and to search for inhibitors for them, which may lead to strategies to delay the development and proliferation of D. citri. In humans, cysteine cathepsins, because they have a variety of actions, make the search for selective inhibitors important. In this context and in search of D. citri cathepsins inhibitors, synthetic compounds were tested as inhibitors of human cathepsins. Thus, the objectives of this work were the identification, recombinant production and characterization of cathepsins B-like and L-like from Diaphorina citri, and testing of oxadiazole compounds as inhibitors of human recombinant cathepsins B, L and K. In silico analyses of D. citri cathepsins DccathL2 and DccathB3 were performed; expression assays in Pichia pastoris; expression in E. coli; solubilization, purification and refolding of proteins; and expression in E. coli of the mutants DccathL2mut and DccathB3mut. Regarding the studies of inhibition of the catalytic activity of human recombinant cathepsins B, L and K, fourteen dipeptide compounds 2-amino-1,3,4-oxadiazoles and nitriles were tested, Ki values were calculated and the inhibition mode was defined. As a result of this work, two D. citri protein sequences of the cathepsin B-like and L-like types were selected for expression in Pichia pastoris, but they were not expressed in this system. Expression in E. coli cells was possible in the insoluble fraction. Following several solubilization and refolding protocols, it was not possible to obtain catalytically active cathepsins. After a new in silico analysis, it was observed that both cathepsins had a mutation in the active site, which promoted the replacement of the cysteine residue by a serine residue. Mutants were synthesized, replacing serine by cysteine, but it was still not possible to obtain catalytically active cathepsins. In parallel, aiming to develop potential synthetic inhibitors for D. citri cysteine cathepsins, the inhibition constants (Ki) of fourteen oxadiazole and nitrile compounds against recombinant human cathepsins B, L and K were determined. The 2-amino-1,3,4-oxadiazole derivative called 10e was 90 times more selective for cathepsin L than cathepsin B. The inhibition mode was determined and proved to be competitive. As conclusions of this work, two pseudo cathepsins B-like and L-like types were identified for the first time in D. citri, containing a serine residue in place of the cysteine residue in the active site. The expressed proteins did not show catalytic activity. The mutant version of DccathL2, where a cysteine was placed in place of the serine residue in the active site, also did not show catalytic activity. Considering the different functions of pseudoenzymes and functional cathepsins of D. citri, we infer that pseudo cathepsins perform auxiliary functions to functional cathepsins. Regarding the study of inhibition of human cathepsins B, L and K, oxadiazole compounds were better inhibitors than nitrile compounds, and some of them stood out for their inhibition efficiency and selectivity among the different human cathepsins studied by us.
Descrição
Citação
CALUCIO, Patricia Lima. Estudo de cisteíno peptidasesdo inseto Diaphorina citri, vetor da doença dos citros Huanglongbing, e seleção de compostos oxadiazólicos como inibidores das catepsinas B, L e K. 2024. 130 f. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). São Paulo, 2024.
Pré-visualização PDF(s)