Detecção do Toxoplasma gondii, no sangue periférico, em pacientes com toxoplasmose ocular utilizando e comparando as técnicas de imunohistoquímica e reação em cadeia da polimerase
Data
2011
Autores
Belfort, Rubens Neto 
Orientadores
Burnier Júnior, Miguel Noel Nascente
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Os mecanismos envolvidos na gravidade e recorrencia da toxoplasmose ocular ainda nao sao bem entendidos. Novos metodos diagnosticos, como a identificacao de parasitas eventualmente circulantes, sao necessarios para diagnosticar casos atipicos e entender melhor os mecanismos de recorrencia. Objetivo: Deteccao do Toxoplasma gondii no sangue periferico de pacientes com diferentes tipos de uveites utilizando as tecnicas de imunohistoquimica e reacao em cadeia da polimerase. Material e metodo: Pacientes com diferentes tipos de uveites e voluntarios saudaveis tiveram 20ml de sangue periferico retirado e seu DNA extraido em ate seis horas da venoclise e armazenado em papel FTA ou congelado. Cepa YFP RH de T. gondii foi cultivado em camada de fibroblastos por 5 semanas. Microscopio de fluorescencia foi usado para determinar a concentracao dos parasitas em suspensao e diluicoes seriadas foram realizadas: de 106 a 100 parasitas por mililitro. Cytospins e esfregaco de sangue total receberam solucao contendo parasitas em diferentes concentracoes e foram submetidos a imunohistoquimica automatizada. Amostras de sangue com diferentes concentracoes de parasitas tiveram seu DNA extraido e foram submetidas a reacao em cadeia da polimerase utilizando dois alvos: um fragmento de 62bp do gene B1 e o fragmento 529bp. Os primers utilizados foram: B1 Forward 5Æ- CTA GTA TCG GTG CGG CAA TGT -3Æe Reverse 5Æ- GGC AGC GTC TCT TCC TCT TTT -3Æ e 529 CGC TGC AGG GAG GAA GAC GAA AGT TG- 3Æ e reverse 5´- CGC TGC AGA CAC AGT GCA TCT GAA TT- 3Æ. Apos a determinacao da tecnica de melhor sensibilidade foram analisadas as amostras de pacientes com diferentes tipos de uveites. Os testes foram realizados em triplicata. Resultados: A reacao de PCR em tempo real foi mais sensivel do que a tecnica de imunohistoquimica para identificar parasitas em sangue periferico. Ao utilizar o fragmento 529bp como alvo obteve-se maior sensibilidade do que ao utilizar o gene B1 como alvo, identificando concentracao de 1 toxo/ml. Foram analisados 32 pacientes, sendo que em duas amostras foi observado resultado positivo da reacao em cadeia da polimerase T. gondii. Estes dois pacientes apresentavam uveites autoimunes, sorologia positiva para toxoplasmose e recebiam medicacao imunossupressora. Conclusoes: A tecnica de imunohistoquimica foi capaz de identificar a presenca de T. gondii no sangue periferico, mas a tecnica de PCR em tempo real apresentou sensibilidade maior. O PCR utilizando o fragmento 529bp como alvo foi mais sensivel do que o PCR utilizando o gene B1 como alvo, provavelmente pelo maior numero de copias no DNA do parasita do fragmento 529 em relacao ao gene B1. Dentre os pacientes estudados, apenas aqueles que recebiam medicacao imunossupressora apresentaram parasitas circulando no sangue periferico
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2011. 104 p.