Caracterização in vitro de neuroesferas e seu potencial de regeneração na doença de alzheimer e lesão por stab wound
Data
2016-03-06
Autores
Paiva, Daisylea de Souza 
Orientadores
Monteiro, Beatriz de Oliveira
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Objetctive: verify the role of neural stem cells (NSC) in three different aspects: in vitro behaviour, use in memory repair in transgenic animals for Alzheimer's Disease (DA, APPswe/PS1dE9) following transplantation, and expression of proteins related to injury response. Methods: We used in vitro techniques for cell culture of neuroespheres, genome-wide techniques as well as transplantation and behavioral tests. Results: We verified that the APPswe/PS1dE9 transgene affect neurospheres growth rate as well as promoting cellular death. Furthermore, is important to note that differentiated astrocytes from AD animals neurospheres presented hypertrophic morphology, alike the astrocytes from WT animals. Therefore, in this model is possible to identify alterations in NSC as well as soluble amyloid precursor protein secretion during the embrionic stage that can promote proliferation without interfere in the normal development of the animal. When transplanted in transfenic animals for DA, NSCs were able to contribute to neural repair by increasing neurogenesis and secretion of BDNF neurotrophin. Nevertheless there was no effect on memory and habituation in transplanted AD animals. Therefore we demonstrated that even without improving memory at behavioural level, NSC transpantation increased the neurotrophic support in hippocampus and can be responsible for other modifications at molecular level that should be better investigated. From the results of in vitro experiments and to better understand the behaviour of astrocytes in AD we decide to compare the expression pattern of proteins overexpressed at the lesion site of the SW (stab wound). To perform this analysis, we used the genome-wide data from Magdalena Götz's lab to select candidates that could play a role in the stab wound lesion and in AD. Among the top upregulated genes in reactive macroglia (astrocytes and NG2-glia), most of them were related to inflammation and, among these genes we selected four candidates (Osteopontin, CD68 and Galectin-1 and -3). We verified that although they were overexpressed in reactive macroglia after SW injury, the same cells do not express these proteins in AD animals. Whereby SW is an accute injury that is healed within few weeks, we assumed that the downregulation of these proteins could be related to the disease chronicity. Conclusion: By evaluating the in vitro features and role in neurodegeneration processes, we verified that when transplanted, NSC secrete factors that increase the neurotrophic support and during development can play a role in compensating cell death in AD animals. However, in old AD animals macroglial cells do not express proteins that could assist lesion resolution. This work offers insights about the role of NSC and macroglia in Alzheimer's disease.
Objetivo: Verificar o papel das células-tronco neurais (CTN) frente à doença de Alzheimer (DA) em três diferentes aspectos: comportamento in vitro, reparação de memória em animais transgênicos para DA por meio de transplante e expressão de proteinas relacionadas com resposta à lesão. Métodos: Foram utilizadas técnicas in vitro de culturas de neuroesferas, ferramentas de genômica ampla além de transplantes e testes comportamentais. Resultados: Verificamos que o transgene APPswe/PS1dE9 exerce efeito no crescimento de esferas, além de promover morte celular. Além disso, é importante notar que astrócitos diferenciados a partir de neuroesferas de animais DA apresentaram morfologia hipertrófica, diferente dos astrócitos de animais WT. Dessa forma, podemos dizer que nesse modelo é possível identificar alterações nas CTN bem como secreção de proteína precursora amilóide solúvel na fase embrionária, que pode promover a proliferação celuar sem prejudicar o desenvolvimento do animal. Quando transplantadas em animais transgênicos para DA, CTNs são capazes de contribuir para a regeneração do tecido nervoso por meio do aumento da neurogênese e da neurotrofina BDNF. Apesar disso, não houve melhora significante na memória e habituação em animais DA transplantados. Sendo assim, demonstramos que apesar de não ter exercido efeito comportamental, as CTN aumentaram o suporte neurotrófico no hipocampo e podem ser responsáveis por outras modificações a nível molecular que devem ser estudadas mais profundamente. A partir dos resultados dos experimentos in vitro e para melhor entendimento do comportamento de astrócitos na DA, decidimos comparar a expressão de proteínas normalmente expressas em uma lesão aguda (stab wound, SW). Para isso, utilizamos os dados da análise genômica ampla do laboratório da Profa. Magdalena Götz para selecionar candidados que poderiam estar envolvidos na lesão por SW e na DA. Dentre os genes mais superexpressos em macroglia (astrócitos e NG2-glia) reativa após SW, a maioria estava relacionada a inflamação e, dentre esses genes, selecionamos quatro candidatos (Osteopontina, CD68, Galectina-1 e -3). Verificamos que, apesar desses marcadores estarem superexpressos por macroglia reativa após SW, os mesmos tipos celulares praticamente não expressam essas proteínas. Como o SW é uma lesão aguda que é cicatrizada em poucas semanas, supomos que a falta dessas proteínas na DA pode contribuir para a cronicidade da doença. Conclusão: Ao verificar as características in vitro e frente à neurodegeneração das CTN concluímos que as mesmas secretam fatores que promovem efeito neurotrófico quando transplantadas e podem colaborar para o desenvolvimento em animais DA. Porém em animais DA idosos células macrogliais deixam de expressar proteínas que poderiam auxiliar na resolução da lesão. Este estudo oferece insights sobre o papel de CTN e macroglia na doença de Alzheimer.
Objetivo: Verificar o papel das células-tronco neurais (CTN) frente à doença de Alzheimer (DA) em três diferentes aspectos: comportamento in vitro, reparação de memória em animais transgênicos para DA por meio de transplante e expressão de proteinas relacionadas com resposta à lesão. Métodos: Foram utilizadas técnicas in vitro de culturas de neuroesferas, ferramentas de genômica ampla além de transplantes e testes comportamentais. Resultados: Verificamos que o transgene APPswe/PS1dE9 exerce efeito no crescimento de esferas, além de promover morte celular. Além disso, é importante notar que astrócitos diferenciados a partir de neuroesferas de animais DA apresentaram morfologia hipertrófica, diferente dos astrócitos de animais WT. Dessa forma, podemos dizer que nesse modelo é possível identificar alterações nas CTN bem como secreção de proteína precursora amilóide solúvel na fase embrionária, que pode promover a proliferação celuar sem prejudicar o desenvolvimento do animal. Quando transplantadas em animais transgênicos para DA, CTNs são capazes de contribuir para a regeneração do tecido nervoso por meio do aumento da neurogênese e da neurotrofina BDNF. Apesar disso, não houve melhora significante na memória e habituação em animais DA transplantados. Sendo assim, demonstramos que apesar de não ter exercido efeito comportamental, as CTN aumentaram o suporte neurotrófico no hipocampo e podem ser responsáveis por outras modificações a nível molecular que devem ser estudadas mais profundamente. A partir dos resultados dos experimentos in vitro e para melhor entendimento do comportamento de astrócitos na DA, decidimos comparar a expressão de proteínas normalmente expressas em uma lesão aguda (stab wound, SW). Para isso, utilizamos os dados da análise genômica ampla do laboratório da Profa. Magdalena Götz para selecionar candidados que poderiam estar envolvidos na lesão por SW e na DA. Dentre os genes mais superexpressos em macroglia (astrócitos e NG2-glia) reativa após SW, a maioria estava relacionada a inflamação e, dentre esses genes, selecionamos quatro candidatos (Osteopontina, CD68, Galectina-1 e -3). Verificamos que, apesar desses marcadores estarem superexpressos por macroglia reativa após SW, os mesmos tipos celulares praticamente não expressam essas proteínas. Como o SW é uma lesão aguda que é cicatrizada em poucas semanas, supomos que a falta dessas proteínas na DA pode contribuir para a cronicidade da doença. Conclusão: Ao verificar as características in vitro e frente à neurodegeneração das CTN concluímos que as mesmas secretam fatores que promovem efeito neurotrófico quando transplantadas e podem colaborar para o desenvolvimento em animais DA. Porém em animais DA idosos células macrogliais deixam de expressar proteínas que poderiam auxiliar na resolução da lesão. Este estudo oferece insights sobre o papel de CTN e macroglia na doença de Alzheimer.
Descrição
Citação
PAIVA, Daisylea de Souza. Caracterização in vitro de neuroesferas e seu potencial de regeneração na doença de alzheimer e lesão por stab wound. 2016. 147 f. Tese (Doutorado em Neurologia - Neurociências) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.