Implementação e padronização de técnicas de dosagem enzimática para detecção de doenças de depósito lisossômico
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Data
2009-02-27
Autores
Müller, Karen Barbosa [UNIFESP]
Orientadores
D'Almeida, Vânia [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Objectives: To implement and to standardize enzymatic activity techniques using dried blood spots on filter paper for the enzymes -galactosidase A, for the diagnosis of Fabry Disease patients; -iduronidase, for the diagnosis of Mucopolysaccharidosis type I patients; -glucosidase and chitotriosidase, for the diagnosis of Gaucher Disease patients and acid -glucosidase, that allows the diagnosis of Pompe Disease patients; besides the enzyme -galactosidase, that allows assessing the quality of the material. In addition, to determine the cut-off value for each enzyme, that will enable the discrimination between healthy subjects and patients. Methodology: 302 volunteers of both gender were selected, with ages between 18 and 82 years old. Peripheral blood was collected in heparin containing tubes and blood spots were prepared according to the protocol. All enzymatic activity techniques carried out in this work were based in the cleavage of a specific synthetic substrate, by the action of target enzymes which then releases a fluorescent molecule that will be detected by the fluorimeter. Results: The values of enzyme activity obtained in this work were the following (mean±standard deviation; minimum and maximum values), expressed in μmol/L/h: -galactosidase (14,09±4,36; 4,04-29,65); -galactosidase A (4,57±1,37; 1,44-10,67); -iduronidase (3,45±1,21; 1,40-7,78); -glucosidase (4,57±1,37; 1,44-10,67); chitotriosidase (12,88±9,84; 0,00-48,07); -glucosidase (5,41±1,74; 2,10-10,65); also expressed in the ratio of neutral -glucosidase/inhibited acid -glucosidase (13,19±4,26; 5,03-28,58); and as % of acid -glucosidase inhibition (70,66±7,60; 36,38-87,08). The sensibility and specificity values obtained with the comparison of leukocytes and dried blood spots results showed that all techniques are reliable and appropriate. Conclusions: The results from this work enabled us to choose the most accurate cut-off values which to distinguish between healthy subjects and patients with Fabry Disease, Mucopolysaccharidosis type I, Gaucher Disease and Pompe Disease. Enzyme activity values are in agreement with the literature data. The use of dried blood spots for lysosomal disease diagnosis can be considered efficient, inexpensive and simple to be performed.
Objetivo: Implementar e padronizar técnicas de dosagem de atividade enzimática em gota seca de sangue em papel de filtro para as seguintes enzimas lisossomais: - galactosidase A, que permite diagnosticar pacientes com Doença de Fabry, - iduronidase, que permite identificar pacientes com Mucopolissacaridose tipo I; - glicosidase e quitotriosidase, que permitem diagnosticar pacientes com Doença de Gaucher e -glicosidase, que permite identificar pacientes com Doença de Pompe, além da enzima -galactosidase, que possibilita avaliar a qualidade do material. Determinar o valor de corte para todas estas enzimas, que irá possibilitar a diferenciação dos indivíduos saudáveis dos pacientes. Metodologia: Ao todo foram selecionados 302 indivíduos, de ambos os sexos e com idades entre 18 e 82 anos. Foram coletados de 5 a 10 mL de sangue periférico de cada voluntário, e posteriormente 4 ou 5 gotas de sangue foram transferidas com o auxílio de uma pipeta tipo Pasteur para um papel de filtro. Todas as técnicas de dosagem de atividade enzimática realizadas neste trabalho baseiam-se na ação da enzima de interesse sobre um substrato sintético específico, que libera após clivagem uma molécula que emite fluorescência. A atividade enzimática será proporcional à quantidade de fluorescência detectada pelo equipamento. Resultados: Com as dosagens de atividade enzimática realizadas neste trabalho foram obtidos os seguintes resultados (média±desvio-padrão; valores mínimos e máximos), expressos em μmol/L/h: -galactosidase (14,09±4,36; 4,04-29,65); -galactosidase A (4,57±1,37; 1,44-10,67); -iduronidase (3,45±1,21; 1,40-7,78); -glicosidase (4,57±1,37; 1,44-10,67); quitotriosidase (12,88±9,84; 0,00- 48,07); -glicosidase (5,41±1,74; 2,10-10,65); também expressa pela razão - glicosidase neutra/ -glicosidase ácida inibida (13,19±4,26; 5,03-28,58); e pela por cento inibição da -glicosidase ácida (70,66±7,60; 36,38-87,08). Os cálculos de sensibilidade e especificidade, realizados confrontando a técnica que utiliza papel de filtro com a técnica que utiliza leucócitos, resultaram em valores acima de 50 por cento, que são considerados adequados. Conclusões: As análises estatísticas dos resultados obtidos possibilitaram a escolha do valor de corte mais preciso, o que permite a diferenciação entre indivíduos saudáveis e pacientes com Doença de Fabry, Doença de Pompe, Doença de Gaucher e Mucopolissacaridose tipo I. Os valores de atividade enzimática observados se mostraram de acordo com os descritos na literatura, com pequenas variações. As técnicas de diagnóstico que utilizam papel de filtro podem ser consideradas uma ferramenta eficiente, barata e simples de serem realizadas. Objetivo: Implementar e padronizar técnicas de dosagem de atividade enzimática em gota seca de sangue em papel de filtro para as seguintes enzimas lisossomais: - galactosidase A, que permite diagnosticar pacientes com Doença de Fabry, - iduronidase, que permite identificar pacientes com Mucopolissacaridose tipo I; - glicosidase e quitotriosidase, que permitem diagnosticar pacientes com Doença de Gaucher e -glicosidase, que permite identificar pacientes com Doença de Pompe, além da enzima -galactosidase, que possibilita avaliar a qualidade do material. Determinar o valor de corte para todas estas enzimas, que irá possibilitar a diferenciação dos indivíduos saudáveis dos pacientes. Metodologia: Ao todo foram selecionados 302 indivíduos, de ambos os sexos e com idades entre 18 e 82 anos. Foram coletados de 5 a 10 mL de sangue periférico de cada voluntário, e posteriormente 4 ou 5 gotas de sangue foram transferidas com o auxílio de uma pipeta tipo Pasteur para um papel de filtro. Todas as técnicas de dosagem de atividade enzimática realizadas neste trabalho baseiam-se na ação da enzima de interesse sobre um substrato sintético específico, que libera após clivagem uma molécula que emite fluorescência. A atividade enzimática será proporcional à quantidade de fluorescência detectada pelo equipamento. Resultados: Com as dosagens de atividade enzimática realizadas neste trabalho foram obtidos os seguintes resultados (média±desvio-padrão; valores mínimos e máximos), expressos em μmol/L/h: -galactosidase (14,09±4,36; 4,04-29,65); -galactosidase A (4,57±1,37; 1,44-10,67); -iduronidase (3,45±1,21; 1,40-7,78); -glicosidase (4,57±1,37; 1,44-10,67); quitotriosidase (12,88±9,84; 0,00- 48,07); -glicosidase (5,41±1,74; 2,10-10,65); também expressa pela razão - glicosidase neutra/ -glicosidase ácida inibida (13,19±4,26; 5,03-28,58); e pela por cento inibição da -glicosidase ácida (70,66±7,60; 36,38-87,08). Os cálculos de sensibilidade e especificidade, realizados confrontando a técnica que utiliza papel de filtro com a técnica que utiliza leucócitos, resultaram em valores acima de 50 por cento, que são considerados adequados. Conclusões: As análises estatísticas dos resultados obtidos possibilitaram a escolha do valor de corte mais preciso, o que permite a diferenciação entre indivíduos saudáveis e pacientes com Doença de Fabry, Doença de Pompe, Doença de Gaucher e Mucopolissacaridose tipo I. Os valores de atividade enzimática observados se mostraram de acordo com os descritos na literatura, com pequenas variações. As técnicas de diagnóstico que utilizam papel de filtro podem ser consideradas uma ferramenta eficiente, barata e simples de serem realizadas.
Objetivo: Implementar e padronizar técnicas de dosagem de atividade enzimática em gota seca de sangue em papel de filtro para as seguintes enzimas lisossomais: - galactosidase A, que permite diagnosticar pacientes com Doença de Fabry, - iduronidase, que permite identificar pacientes com Mucopolissacaridose tipo I; - glicosidase e quitotriosidase, que permitem diagnosticar pacientes com Doença de Gaucher e -glicosidase, que permite identificar pacientes com Doença de Pompe, além da enzima -galactosidase, que possibilita avaliar a qualidade do material. Determinar o valor de corte para todas estas enzimas, que irá possibilitar a diferenciação dos indivíduos saudáveis dos pacientes. Metodologia: Ao todo foram selecionados 302 indivíduos, de ambos os sexos e com idades entre 18 e 82 anos. Foram coletados de 5 a 10 mL de sangue periférico de cada voluntário, e posteriormente 4 ou 5 gotas de sangue foram transferidas com o auxílio de uma pipeta tipo Pasteur para um papel de filtro. Todas as técnicas de dosagem de atividade enzimática realizadas neste trabalho baseiam-se na ação da enzima de interesse sobre um substrato sintético específico, que libera após clivagem uma molécula que emite fluorescência. A atividade enzimática será proporcional à quantidade de fluorescência detectada pelo equipamento. Resultados: Com as dosagens de atividade enzimática realizadas neste trabalho foram obtidos os seguintes resultados (média±desvio-padrão; valores mínimos e máximos), expressos em μmol/L/h: -galactosidase (14,09±4,36; 4,04-29,65); -galactosidase A (4,57±1,37; 1,44-10,67); -iduronidase (3,45±1,21; 1,40-7,78); -glicosidase (4,57±1,37; 1,44-10,67); quitotriosidase (12,88±9,84; 0,00- 48,07); -glicosidase (5,41±1,74; 2,10-10,65); também expressa pela razão - glicosidase neutra/ -glicosidase ácida inibida (13,19±4,26; 5,03-28,58); e pela por cento inibição da -glicosidase ácida (70,66±7,60; 36,38-87,08). Os cálculos de sensibilidade e especificidade, realizados confrontando a técnica que utiliza papel de filtro com a técnica que utiliza leucócitos, resultaram em valores acima de 50 por cento, que são considerados adequados. Conclusões: As análises estatísticas dos resultados obtidos possibilitaram a escolha do valor de corte mais preciso, o que permite a diferenciação entre indivíduos saudáveis e pacientes com Doença de Fabry, Doença de Pompe, Doença de Gaucher e Mucopolissacaridose tipo I. Os valores de atividade enzimática observados se mostraram de acordo com os descritos na literatura, com pequenas variações. As técnicas de diagnóstico que utilizam papel de filtro podem ser consideradas uma ferramenta eficiente, barata e simples de serem realizadas. Objetivo: Implementar e padronizar técnicas de dosagem de atividade enzimática em gota seca de sangue em papel de filtro para as seguintes enzimas lisossomais: - galactosidase A, que permite diagnosticar pacientes com Doença de Fabry, - iduronidase, que permite identificar pacientes com Mucopolissacaridose tipo I; - glicosidase e quitotriosidase, que permitem diagnosticar pacientes com Doença de Gaucher e -glicosidase, que permite identificar pacientes com Doença de Pompe, além da enzima -galactosidase, que possibilita avaliar a qualidade do material. Determinar o valor de corte para todas estas enzimas, que irá possibilitar a diferenciação dos indivíduos saudáveis dos pacientes. Metodologia: Ao todo foram selecionados 302 indivíduos, de ambos os sexos e com idades entre 18 e 82 anos. Foram coletados de 5 a 10 mL de sangue periférico de cada voluntário, e posteriormente 4 ou 5 gotas de sangue foram transferidas com o auxílio de uma pipeta tipo Pasteur para um papel de filtro. Todas as técnicas de dosagem de atividade enzimática realizadas neste trabalho baseiam-se na ação da enzima de interesse sobre um substrato sintético específico, que libera após clivagem uma molécula que emite fluorescência. A atividade enzimática será proporcional à quantidade de fluorescência detectada pelo equipamento. Resultados: Com as dosagens de atividade enzimática realizadas neste trabalho foram obtidos os seguintes resultados (média±desvio-padrão; valores mínimos e máximos), expressos em μmol/L/h: -galactosidase (14,09±4,36; 4,04-29,65); -galactosidase A (4,57±1,37; 1,44-10,67); -iduronidase (3,45±1,21; 1,40-7,78); -glicosidase (4,57±1,37; 1,44-10,67); quitotriosidase (12,88±9,84; 0,00- 48,07); -glicosidase (5,41±1,74; 2,10-10,65); também expressa pela razão - glicosidase neutra/ -glicosidase ácida inibida (13,19±4,26; 5,03-28,58); e pela por cento inibição da -glicosidase ácida (70,66±7,60; 36,38-87,08). Os cálculos de sensibilidade e especificidade, realizados confrontando a técnica que utiliza papel de filtro com a técnica que utiliza leucócitos, resultaram em valores acima de 50 por cento, que são considerados adequados. Conclusões: As análises estatísticas dos resultados obtidos possibilitaram a escolha do valor de corte mais preciso, o que permite a diferenciação entre indivíduos saudáveis e pacientes com Doença de Fabry, Doença de Pompe, Doença de Gaucher e Mucopolissacaridose tipo I. Os valores de atividade enzimática observados se mostraram de acordo com os descritos na literatura, com pequenas variações. As técnicas de diagnóstico que utilizam papel de filtro podem ser consideradas uma ferramenta eficiente, barata e simples de serem realizadas.
Descrição
Citação
MÜLLER, Karen Barbosa. Implementação e padronização de técnicas de dosagem enzimática para detecção de doenças de depósito lisossômico. 2009. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2009.