Heparinases: clonagem, expressão e requisitos estruturais para a atividade
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Data
2011-04-27
Autores
Córdula, Carolina Ribeiro 
Orientadores
Nader, Helena Bonciani
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Structural characteristics of heparin (Hep) and heparan sulfate (HS) have been determined using enzymes from Flavobacterium heparinum, a non-pathogenic soil bacterium. Upon induction with Hep/HS or their disaccharides as the sole source of carbon and nitrogen, the bacteria synthesize heparinase, and heparitinases I and II. This lyases cleaves heparin and HS by a -eliminative process in a random endolytic pattern. Heparitinase I cleaves exclusively Nacetyl or N-sulfo-glucosaminide-glucuronic acid linkage of HS/Hep without C6 sulfate substitution; Heparitinase II cleaves N-acetyl-6-sulfo or N-sulfo or N,6- sulfo glucosaminide-glucuronic/ iduronic acid linkage of HS/Hep without C3 sulfate substitution. Heparinase cleaves an -D-glucosamine N- and 6-sulfated (14) -L-iduronate 2-sulfated, present in heparin. This work aims to cloning and express heparinase and heparitinase I and study de kinetic behavior of heparinase. Recombinant enzymes were expressed in E. coli using the T7 polymerase pET expression system. The work shows that heparin-Ca2+- heparinase I complex is the true substrate for heparinase (KS = 1.4±0.1μM), whereas heparin Ca2+ free (KI=12±2μM) as an important pharmaceutical contaminant of commercial heparin, oversulfate chondroitin sulfate (OSCS) (Ki= 0.65μM) are competitive inhibitors. The pKa values of the prototropic groups of the active site were determined by measuring the pH-, solvent- and temperature-dependence upon kcat/KSA, kcat and KSA constants. The results show, at pHoptimium=6.67±0.05, a deprotonated histidine residue initiating the - elimination reaction by the abstraction of the C5 proton of the -L-iduronate 2- O-sulfate residue; and a tyrosin residue in a protonated form acting as a proton donor to the hexosamine leaving group. Mutations of histidine 165 and glutamine 163 residue were performed and kinetic analysis show specific activity maintenance (5,0 e-007 Abs/μg.s), suggesting that H165 and Q163 were not essencial for the heparinase activity.
Características estruturais de heparina (Hep) e heparam sulfato (HS) têm sido determinadas usando enzima de Flavobacterium heparinum, uma bactéria de solo, não-patogênica. Sob indução com Hep/HS ou seus dissacarídeos como única fonte de carbono e nitrogênio, a bactéria sintetiza heparinase e heparitinases I e II. Essas liases clivam heparina e HS por um processo - eliminativo em um padrão endolítico aleatório. Heparitinase I cliva exclusivamente ligações -D-glucosamina N-acetilada ou N-sulfatada (14) β- D-glucuronato de HS/Hep sem haver substituição de sulfato em C6; Heparitinase II cliva ligações -D-glucosamina N-acetil-6-sulfato ou N-sulfato ou N,6-sulfato (14) β-D-glucuronato ou -L- iduronato de HS/Hep, sem haver substituição de sulfato em C3. Heparinase cliva uma -D-glucosamina N- e 6- sulfato (14) -L- iduronato 2-sulfato, presente em heparina. Este trabalho objetiva clonar e expressar heparinase e heparitinase I e estudar o comportamento cinético da heparinase. As enzimas recombinantes foram expressas em E. coli usando o sistema de expressão pET T7 polimerase. O trabalho mostrou que o complexo heparina-Ca2+-heparinase é o substrato verdadeiro para heparinase (KS = 1.4±0.1μM), enquanto que tanto a heparina livre de Ca2+ (KI= 12±2μM) como também um importante contaminante farmacêutico de heparina comercial, condroitim sulfato super sulfatado (OSCS) (KI= 0.65μM) são inibidores competitivos. Os valores de pKa dos grupos prototrópicos do sítio ativo foram determinados pela medida pH-, solvente- e temperatura-dependente sobre as contantes kcat/KS, kcat e KS. Os resultados mostram, em pHótimo=6.67±0.05, um resíduo de histidina desprotonada iniciando a reação de -eliminação pela abstração do próton de C5 do resíduo -L-iduronato 2-O-sulfato; e um resíduo de tirosina na forma protonada agindo como um doador de próton para o anel de hexosamina liberada. Mutações dos residues de histidina 165 e glutamina 163 foram realizadas e análises cinéticas mostraram a manutenção da atividade específica (5,0 e-007 Abs/μg.s), sugerindo que os resíduos H165 e Q163 não são essenciais para a atividade da heparinase.
Características estruturais de heparina (Hep) e heparam sulfato (HS) têm sido determinadas usando enzima de Flavobacterium heparinum, uma bactéria de solo, não-patogênica. Sob indução com Hep/HS ou seus dissacarídeos como única fonte de carbono e nitrogênio, a bactéria sintetiza heparinase e heparitinases I e II. Essas liases clivam heparina e HS por um processo - eliminativo em um padrão endolítico aleatório. Heparitinase I cliva exclusivamente ligações -D-glucosamina N-acetilada ou N-sulfatada (14) β- D-glucuronato de HS/Hep sem haver substituição de sulfato em C6; Heparitinase II cliva ligações -D-glucosamina N-acetil-6-sulfato ou N-sulfato ou N,6-sulfato (14) β-D-glucuronato ou -L- iduronato de HS/Hep, sem haver substituição de sulfato em C3. Heparinase cliva uma -D-glucosamina N- e 6- sulfato (14) -L- iduronato 2-sulfato, presente em heparina. Este trabalho objetiva clonar e expressar heparinase e heparitinase I e estudar o comportamento cinético da heparinase. As enzimas recombinantes foram expressas em E. coli usando o sistema de expressão pET T7 polimerase. O trabalho mostrou que o complexo heparina-Ca2+-heparinase é o substrato verdadeiro para heparinase (KS = 1.4±0.1μM), enquanto que tanto a heparina livre de Ca2+ (KI= 12±2μM) como também um importante contaminante farmacêutico de heparina comercial, condroitim sulfato super sulfatado (OSCS) (KI= 0.65μM) são inibidores competitivos. Os valores de pKa dos grupos prototrópicos do sítio ativo foram determinados pela medida pH-, solvente- e temperatura-dependente sobre as contantes kcat/KS, kcat e KS. Os resultados mostram, em pHótimo=6.67±0.05, um resíduo de histidina desprotonada iniciando a reação de -eliminação pela abstração do próton de C5 do resíduo -L-iduronato 2-O-sulfato; e um resíduo de tirosina na forma protonada agindo como um doador de próton para o anel de hexosamina liberada. Mutações dos residues de histidina 165 e glutamina 163 foram realizadas e análises cinéticas mostraram a manutenção da atividade específica (5,0 e-007 Abs/μg.s), sugerindo que os resíduos H165 e Q163 não são essenciais para a atividade da heparinase.
Descrição
Citação
CÓRDULA, Carolina Ribeiro. Heparinases: Clonagem, Expressão e Requisitos Estruturais para a Atividade. 2011. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2011.