Estudos sobre o potencial de virulência e filogenia de amostras de Escherichia coli do sorotipo O113:H21
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Data
2011-02-22
Autores
Santos, Luis Fernando dos [UNIFESP]
Orientadores
Guth, Beatriz Ernestina Cabilio [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Título de Volume
Resumo
In this study 37 O113:H21 Escherichia coli strains isolated from human infections (03 samples), the animal reservoir (33 samples) and food (1 sample) in different regions of Brazil, were analyzed for their genotypic and phenotypic virulence traits and genetic and phylogenetic backgrounds. The presence of the stx gene, defining the STEC pathotype was observed in all samples of non-human origin. Human samples, lacking this gene, were classified as non-STEC. The search for genes related to the production of toxins, adhesins and autotransporter proteins revealed the occurrence of distinct virulence profiles among samples of different origins. Among the STEC strains the profile composed of ehxA, subAB, epeA, espP, lpfO113, iha and saa, associated or not to cdt-V was the most prevalent. Non-STEC isolates harbored only astA, lpfO113 and iha. The genotype stx2dactivatablewas found in most of the STEC samples. High mass plasmids occurred in 25 of the 37 studied strains, but only in STEC group these plasmids could be confirmed as being the STEC O113 megaplasmid pO113. STEC isolates were also investigated for the occurrence of subtypes of genes and ehxA and regarding the enterohemolysin gene only the subtype A was found; in relation to saa, four distinct subtypes of this gene were present among the studied strains. These subtypes corresponded to variants of 500 to 800 base pairs. Cytotoxicity assays revealed the ability for the expression of subAB and cdt-V genes in 13 and 07 STEC strains respectively. Interaction assays using Caco-2 and T84 cell lines demonstrated that 13 strains had the capacity of invading the cells. Ability to form biofilm in different temperatures was observed in the majority of the studied strains. The search for the presence and expression of curli and type I fimbriae related genes were found to give positive results for the majority of the strains; however this fact had no correlation with biofilm production. Transcription of adhesin genes saa, iha and lpfO113 were investigated by RT-PCR, being the majority of the strains positive in such assays. Once more, there was no correlation between the RT-PCR results and the phenotypic virulence properties investigated. Distinct clusters were identified by PFGE analysis among the studied strains. Genetic similarity indices ranged from 65 to 100% among these clusters. MLST demonstrated the existence of phylogenetic relationship among O113:H21 STEC strains of different origins. These results indicate the presence in our settings of O113:H21 STEC isolates carrying virulence properties commonly found only in O113:H21 clones associated with SHU cases in other countries.
Neste trabalho 37 amostras de Escherichia coli do sorotipo O113:H21, isoladas de infecções humanas (03 amostras), do reservatório animal (33 amostras) e de alimentos (1 amostra), em diferentes regiões brasileiras, foram analisadas quanto à suas características genotípicas e fenotípicas de virulência, sua diversidade genética e filogenética. A presença do gene stx, definindo o patotipo STEC foi observada em todas as amostras de origem não humana. Amostras humanas, desprovidas deste gene foram classificadas como não-STEC. A pesquisa de outros genes relacionados à produção de toxinas, adesinas e proteínas autotransportadoras revelou a ocorrência de distintos perfis de virulência entre amostras de diferentes origens. Dentre as amostras STEC o perfil composto pelos genes ehxA, subAB, epeA, espP, lpfO113, iha e saa, associados ou não à cdt-V foi o mais prevalente. Amostras não-STEC apresentaram somente astA, lpfO113 e iha. O genótipo stx2d-ativável foi encontrado na maioria das amostras STEC. Plasmídeos de alta massa molecular ocorreram em 25 das 37 amostras estudadas, mas apenas nas amostras STEC estes plasmídeos puderam ser caracterizados como sendo o plasmídeo de virulência característico de STEC O113:H21, pO113. Amostras STEC foram investigadas quanto a ocorrência de subtipos dos genes ehxA e saa. Em relação ao gene de enterohemolisina apenas o subtipo A foi encontrado; quanto ao gene saa, quatro subtipos distintos deste gene estiveram presentes entre as amostras estudadas. Estes subtipos corresponderam a variantes de 500 a 800 pb. Ensaios de citotoxicidade revelaram a capacidade de expressão dos genes para as toxinas SubAB e CDT-V em 13 e 07 das amostras STEC respectivamente. Em ensaios de interação das bactérias em estudo com as linhagens celulares Caco-2 e T84, 13 amostras, todas STEC, apresentaram capacidade invasora. A capacidade de formação de biofilme em diferentes temperaturas (28oC e 37oC), testada em todas as amostras em placas de poliestireno, foi observada na maioria das amostras, tendo este fenômeno ocorrido nas duas condições testadas. A pesquisa em nível genotípico e fenotípico das fimbrias curli e do tipo I revelou que embora a maioria das amostras seja portadora destas estruturas, não houve uma correlação entre a presença das fimbrias e a capacidade de formação de biofilme. Análises sobre a expressão dos genes das adesinas Saa, Iha e LpfO113 por RTPCR demonstraram que embora a transcrição destes genes ocorra na maioria das amostras STEC este fato não teve nenhuma correlação com as características fenotípicas de virulência que foram estudadas. A análise da diversidade genética das amostras por PFGE permitiu a identificação de distintos clusters, com índices de similaridade genética que variaram de 65 a 100%. As análises filogenéticas demonstraram que em termos de grupo filogenético exceto por uma amostra todas as E. coli O113:H21 pertencem ao grupo B1. Ensaios de MLST demonstraram haver uma relação filogenética entre amostras STEC O113:H21 de origem animal e amostras humanas deste sorotipo. Os resultados obtidos demonstram a ocorrência em nosso meio de amostras STEC O113:H21 com características de virulência e filogenéticas semelhantes a amostras isoladas de casos de SHU em outros países.
Neste trabalho 37 amostras de Escherichia coli do sorotipo O113:H21, isoladas de infecções humanas (03 amostras), do reservatório animal (33 amostras) e de alimentos (1 amostra), em diferentes regiões brasileiras, foram analisadas quanto à suas características genotípicas e fenotípicas de virulência, sua diversidade genética e filogenética. A presença do gene stx, definindo o patotipo STEC foi observada em todas as amostras de origem não humana. Amostras humanas, desprovidas deste gene foram classificadas como não-STEC. A pesquisa de outros genes relacionados à produção de toxinas, adesinas e proteínas autotransportadoras revelou a ocorrência de distintos perfis de virulência entre amostras de diferentes origens. Dentre as amostras STEC o perfil composto pelos genes ehxA, subAB, epeA, espP, lpfO113, iha e saa, associados ou não à cdt-V foi o mais prevalente. Amostras não-STEC apresentaram somente astA, lpfO113 e iha. O genótipo stx2d-ativável foi encontrado na maioria das amostras STEC. Plasmídeos de alta massa molecular ocorreram em 25 das 37 amostras estudadas, mas apenas nas amostras STEC estes plasmídeos puderam ser caracterizados como sendo o plasmídeo de virulência característico de STEC O113:H21, pO113. Amostras STEC foram investigadas quanto a ocorrência de subtipos dos genes ehxA e saa. Em relação ao gene de enterohemolisina apenas o subtipo A foi encontrado; quanto ao gene saa, quatro subtipos distintos deste gene estiveram presentes entre as amostras estudadas. Estes subtipos corresponderam a variantes de 500 a 800 pb. Ensaios de citotoxicidade revelaram a capacidade de expressão dos genes para as toxinas SubAB e CDT-V em 13 e 07 das amostras STEC respectivamente. Em ensaios de interação das bactérias em estudo com as linhagens celulares Caco-2 e T84, 13 amostras, todas STEC, apresentaram capacidade invasora. A capacidade de formação de biofilme em diferentes temperaturas (28oC e 37oC), testada em todas as amostras em placas de poliestireno, foi observada na maioria das amostras, tendo este fenômeno ocorrido nas duas condições testadas. A pesquisa em nível genotípico e fenotípico das fimbrias curli e do tipo I revelou que embora a maioria das amostras seja portadora destas estruturas, não houve uma correlação entre a presença das fimbrias e a capacidade de formação de biofilme. Análises sobre a expressão dos genes das adesinas Saa, Iha e LpfO113 por RTPCR demonstraram que embora a transcrição destes genes ocorra na maioria das amostras STEC este fato não teve nenhuma correlação com as características fenotípicas de virulência que foram estudadas. A análise da diversidade genética das amostras por PFGE permitiu a identificação de distintos clusters, com índices de similaridade genética que variaram de 65 a 100%. As análises filogenéticas demonstraram que em termos de grupo filogenético exceto por uma amostra todas as E. coli O113:H21 pertencem ao grupo B1. Ensaios de MLST demonstraram haver uma relação filogenética entre amostras STEC O113:H21 de origem animal e amostras humanas deste sorotipo. Os resultados obtidos demonstram a ocorrência em nosso meio de amostras STEC O113:H21 com características de virulência e filogenéticas semelhantes a amostras isoladas de casos de SHU em outros países.
Descrição
Citação
SANTOS, Luis Fernando dos. Estudos sobre o potencial de virulência e filogenia de amostras de Escherichia coli do sorotipo O113:H21. 2011. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2011.
Palavras-chave
Diversidade genética, Invasão, Marcadores de virulência, Escherichia coli produtora de toxina Shiga, Genetic variation, Virulence factors, Fatores de virulência, Infecções por Escherichia coli, Escherichia coli infections, Proteínas de Escherichia coli/genética, Escherichia coli Proteins/genetics, Escherichia coli Shiga toxigênica, Shiga-toxigenic Escherichia coli, Toxina Shiga, Shiga toxin