Caracterização de microdomínios de membrana resitentes a detergente não iônico em promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis. Papel dos microdomínios na infectividade
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Data
2006-12-31
Autores
Yoneyama, Kelly Aparecida Geraldo [UNIFESP]
Orientadores
Straus, Anita Hilda [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Glycoconjugates present in Leishmania surface are an important class of molecules involved in parasite-macrophage interaction. The structural elucidation of Leishmania (Viannia) braziliensis promastigote glycolipids is very relevant because in this specie the glycolipids represent the major promastigote surface glycoconjugate. Six glycolipid fractions, termed B1 to B6, were purified from L. (V.) braziliensis promastigotes by high performance liquid chromatography. All fractions were sensitive to mild alkaline hydrolysis and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis showed the presence of mannose, galactose, glucose, glucosamine and myo-inositol suggesting that glycolipids are glycoinositolphospholipids (GIPLs). The partially methylated alditol acetates analysis showed the presence of 2,4-di-O-methyl-mannitol tetracetate and 2,3,4,6- tetra-O-methyl-galactitol diacetate suggesting a branched oligosaccharide structure containing terminal galactose residue. These results indicate that L. (V.) braziliensis promastigotes express GIPLs which could be included in the hybrid GIPLs class, although present new glycan structures. The concept of lipid rafts, and membrane microdomains, which are non-ionic detergent-resistant at 4°C, enriched by cholesterol and sphingolipid, have being developed in the last years and have being involved in many processes such as adhesion, signal transduction, endocytosis and polarized traffic of proteins. Recently it was demonstrated the presence of these microdomains in T. brucei and L. (L.) major, suggesting a broad distribution throughout the Kinetoplastida. Membrane microdomains present in L. (V.) braziliensis promastigotes were analyzed using two protocols. The first was based on insolubility in non-ionic detergent at 4°C and the second was based on the low density of these membranes. Detergent-resistant membranes (DRMs) were purified by ultracentrifugation on sucrose gradient. About 85% of GIPLs, 85% of sterols, 65% of inositol phosphorylceramide and 35% of phospholipids were detected in detergent-insoluble fraction at 4°C. The presence of GIPLs, sterols and IPC were also verified on DRMs fractions obtained after ultracentrifugation. By GC-MS it was verified that GIPLs and IPC are composed mainly by saturated fatty acids. On the other hand, the detergentsoluble fraction present 65% of phospholipids, which contain higher percentage of unsaturated fatty acids. Analysis by SDS-PAGE demonstrated the presence of 46 kDa (glyco)protein that could correspond to the gp46 anchored in membrane by GPI, and related with protective immunity in mice immunized with this purified glycoprotein. Parasites depleted of sterols after treatment with ketoconazole and methyl-β-cyclodextrin (MβCD) were used in macrophage infectivity. Analysis of infectivity index showed that MβCD at 20 mM and 40 mM inhibited 53% and 50% of L. (V.) braziliensis infectivity, respectively. Parasites treated with MβCD at 40 mM showed a 70% sterol depletion and their GIPLs were present mainly in the fractions containing detergentsoluble components, indicating the this drug disrupted the membrane microdomains. Parasites treated with ketoconazole presented an inhibition of 92% of macrophage infectivity. The high inhibition of macrophage infectivity by parasites treated with ketoconazole could be related with low membrane microdomains disruption and with morphological changes observed in promastigotes mainly in their flagellar structure, suggesting the involvement of flagella in macrophage infectivity by L. (V.) braziliensis promastigotes. The results presented in these work demonstrate that the intact membrane microdomains are essential for L. (V.) braziliensis infectivity.
A elucidação estrutural de glicoconjugados de superfície de Leishmania é um tema de grande relevância uma vez que estes componentes mostram-se envolvidos em diversos processos na interação do parasita com a célula hospedeira. Desse modo, seis frações glicolipídicas, denominadas de B1 a B6, foram purificadas de promastigotas de L. (V.) braziliensis por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Todas as frações foram lábeis à hidrólise alcalina suave e as análises por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC/MS) demonstraram a presença de manose, galactose, glucose, glucosamina e myo-inositol, sugerindo que os glicolipídeos sejam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs). A análise dos alditóis acetato parcialmente metilados (PMAAs) mostrou a presença de 2,4-di-O-metil-manitol tetracetato, sugerindo uma estrutura glicana ramificada contendo resíduo de galactose terminal, decorrente da presença de 2,3,4,6-tetra-O-metilgalactitol diacetato entre os PMAAs. A reatividade com o anticorpo monoclonal (mAb) ST-3 também sugere a presença de resíduos de Galβ1→3Galα na porção glicana dos GIPLs. Estes resultados indicam que promastigotas de L. (V.) braziliensis expressam GIPLs, os quais possivelmente possam ser incluídos nos GIPLs tipo híbrido apresentando, entretanto, novas estruturas glicanas. As células de mamíferos apresentam microdomínios de membranas resistentes a detergente (DRMs), enriquecidos em colesterol e esfingolipídeos e que mostram-se envolvidos em processos de adesão, sinalização celular, processos de endocitose e tráfego polarizado de proteínas. Estudos recentes também têm demonstrado a presença destes microdomínios em T. brucei e L. (L.) major, sugerindo uma ampla distribuição na ordem Kinetoplastida. Para os estudos dos microdomínios de membrana em promastigotas de L. (V.) braziliensis foram utilizados basicamente dois protocolos, um baseado na insolubilidade em detergente não-iônico a 4ºC e outro baseado na baixa densidade dessas regiões, onde as DRMs podem ser purificadas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Cerca de 85% dos GIPLs e dos esteróis foram detectados na fração insolúvel ao Triton X-100 1% a 4ºC. A presença de GIPLs, IPC e esteróis também foi verificada nas frações contendo as DRMs obtidas após ultracentrifugação. Análises por GC/MS mostraram que GIPLs e IPC apresentam alta proporção de ácidos graxos saturados. Por outro lado, a fração solúvel ao Triton X-100 1% a 4ºC apresentou 65% dos fosfolipídeos, os quais contêm, preferencialmente, ácidos graxos insaturados. As análises dos componentes protéicos por PAGE-SDS demonstraram a presença de uma proteína de aproximadamente 46 kDa, enriquecida nas DRMs, e que pode corresponder à glicoproteína de 46 kDa (gp46) que é ancorada à membrana via GPI e está relacionada com a imunidade protetiva em camundongos previamente imunizados com a glicoproteína purificada. Parasitas tratados com cetoconazol ou metil-β- ciclodextrina (MβCD) foram utilizados em ensaios de infectividade em macrófagos, uma vez que a depleção do conteúdo de esteróis poderia resultar na desestruturação dos microdomínios de membrana. A análise dos índices de infectividade demonstraram que MβCD 20 mM e 40 mM inibiu, respectivamente, 53% e 50% da infectividade. Parasitas tratados com 40 mM de MβCD apresentaram uma depleção de 70% no conteúdo de esteróis e um alto grau de desestruturação dos microdomínios de membrana, uma vez que a análise da distribuição dos GIPLs mostrou um deslocamento deste componente da região de membranas de baixa densidade para as frações solúveis. Parasitas tratados com cetoconazol apresentaram uma redução de 92% da infectividade. No entanto, parte desta inibição pode ser devido ao pequeno grau de desestruturação dos microdomínios de membrana, e parte resultante das alterações morfológicas observadas nos promastigotas, principalmente em nível de estrutura flagelar, sugerindo o envolvimento do flagelo na infecção em macrófago por este espécie de Leishmania. Os resultados apresentados nesta tese confirmam um importante papel para os microdomínios de membrana de promastigotas de L. (V.) braziliensis na infectividade em macrófago.
A elucidação estrutural de glicoconjugados de superfície de Leishmania é um tema de grande relevância uma vez que estes componentes mostram-se envolvidos em diversos processos na interação do parasita com a célula hospedeira. Desse modo, seis frações glicolipídicas, denominadas de B1 a B6, foram purificadas de promastigotas de L. (V.) braziliensis por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Todas as frações foram lábeis à hidrólise alcalina suave e as análises por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC/MS) demonstraram a presença de manose, galactose, glucose, glucosamina e myo-inositol, sugerindo que os glicolipídeos sejam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs). A análise dos alditóis acetato parcialmente metilados (PMAAs) mostrou a presença de 2,4-di-O-metil-manitol tetracetato, sugerindo uma estrutura glicana ramificada contendo resíduo de galactose terminal, decorrente da presença de 2,3,4,6-tetra-O-metilgalactitol diacetato entre os PMAAs. A reatividade com o anticorpo monoclonal (mAb) ST-3 também sugere a presença de resíduos de Galβ1→3Galα na porção glicana dos GIPLs. Estes resultados indicam que promastigotas de L. (V.) braziliensis expressam GIPLs, os quais possivelmente possam ser incluídos nos GIPLs tipo híbrido apresentando, entretanto, novas estruturas glicanas. As células de mamíferos apresentam microdomínios de membranas resistentes a detergente (DRMs), enriquecidos em colesterol e esfingolipídeos e que mostram-se envolvidos em processos de adesão, sinalização celular, processos de endocitose e tráfego polarizado de proteínas. Estudos recentes também têm demonstrado a presença destes microdomínios em T. brucei e L. (L.) major, sugerindo uma ampla distribuição na ordem Kinetoplastida. Para os estudos dos microdomínios de membrana em promastigotas de L. (V.) braziliensis foram utilizados basicamente dois protocolos, um baseado na insolubilidade em detergente não-iônico a 4ºC e outro baseado na baixa densidade dessas regiões, onde as DRMs podem ser purificadas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Cerca de 85% dos GIPLs e dos esteróis foram detectados na fração insolúvel ao Triton X-100 1% a 4ºC. A presença de GIPLs, IPC e esteróis também foi verificada nas frações contendo as DRMs obtidas após ultracentrifugação. Análises por GC/MS mostraram que GIPLs e IPC apresentam alta proporção de ácidos graxos saturados. Por outro lado, a fração solúvel ao Triton X-100 1% a 4ºC apresentou 65% dos fosfolipídeos, os quais contêm, preferencialmente, ácidos graxos insaturados. As análises dos componentes protéicos por PAGE-SDS demonstraram a presença de uma proteína de aproximadamente 46 kDa, enriquecida nas DRMs, e que pode corresponder à glicoproteína de 46 kDa (gp46) que é ancorada à membrana via GPI e está relacionada com a imunidade protetiva em camundongos previamente imunizados com a glicoproteína purificada. Parasitas tratados com cetoconazol ou metil-β- ciclodextrina (MβCD) foram utilizados em ensaios de infectividade em macrófagos, uma vez que a depleção do conteúdo de esteróis poderia resultar na desestruturação dos microdomínios de membrana. A análise dos índices de infectividade demonstraram que MβCD 20 mM e 40 mM inibiu, respectivamente, 53% e 50% da infectividade. Parasitas tratados com 40 mM de MβCD apresentaram uma depleção de 70% no conteúdo de esteróis e um alto grau de desestruturação dos microdomínios de membrana, uma vez que a análise da distribuição dos GIPLs mostrou um deslocamento deste componente da região de membranas de baixa densidade para as frações solúveis. Parasitas tratados com cetoconazol apresentaram uma redução de 92% da infectividade. No entanto, parte desta inibição pode ser devido ao pequeno grau de desestruturação dos microdomínios de membrana, e parte resultante das alterações morfológicas observadas nos promastigotas, principalmente em nível de estrutura flagelar, sugerindo o envolvimento do flagelo na infecção em macrófago por este espécie de Leishmania. Os resultados apresentados nesta tese confirmam um importante papel para os microdomínios de membrana de promastigotas de L. (V.) braziliensis na infectividade em macrófago.
Descrição
Citação
YONEYAMA, Kelly Aparecida Geraldo. Caracterização de microdomínios de membrana resitentes a detergente não iônico em promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis. Papel dos microdomínios na infectividade. 2006. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2006.