Potential diagnostic of Branched-Chain Ketoaciduria by HPLC-DAD

Abstract

A system of high performance liquid chromatography (HPLC) was used for the development and validation of efficient method for quantitative determination of three aminoacids involved in the inherited metabolic disease Branched-Chain Ketoaciduria (BCK), also called maple syrup urine disease. The analytical conditions were selected in order to obtain baseline separation profiles of the amino acids known to be altered in blood plasma of BCK patients, namely L-valine, L-isoleucine, and L-leucine. Most accurate data were obtained using HPLC/diode detector. As the analytes do not have chromophore groups, they were pre-derivatized with o-phthaldialdehyde (OPA), yielding an unsaturated adduct, making thus possible the detection of amino acids. The validation was conducted according to National Health Surveillance Agency (ANVISA) and Guidance for Industry (Bioanalytical Method Validation) United States Food and Drug Administration (U.S. FDA). The results were satisfactory, with high sensitivity, good linearity, precision and accuracy, limit of detection and quantification, all within the established parameters for bioanalytical methods, showing its applicability and low cost compared to other existing techniques such as sequential mass spectrometry. For the three amino acids, L-valine, L-isoleucine and L-leucine, the detection limits (LOD) found were: 1.61, 1.84 and 1.88 mmol L- 1 and the quantification limits (LOQ) 4.37, 6.13 and 6.27 mmol L- 1, respectively.

Neste trabalho, um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi usado para desenvolver e validar um eficiente método para determinar quantitativamente aminoácidos envolvidos na desordem rara conhecida como cetonúria de aminoácidos de cadeia ramificada ou doença do xarope de bordo. As condições analíticas foram desenvolvidas para obter os perfis dos aminoácidos de L-valina, L-isoleucina e L-leucina, sabidamente alterados no plasma sanguíneo dos pacientes. Empregou-se HPLC provido de um detector com arranjo de diodo. Os analitos não possuem grupos cromóforos e, por isso, foram pré-derivatizados com o-ftalaldeído (OPA) para tornar possível sua detecção. A validação foi conduzida de acordo com as normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (RDC No. 27, de 17 de maio de 2012) e secção de validação de bioanalítica da United States Food and Drug Administration (U.S. FDA). Os resultados foram satisfatórios, apresentando alta sensibilidade, boa linearidade, precisão e exatidão, limite de detecção e quantificação, todos parâmetros estabelecidos para métodos bioanalíticos, demonstrando a aplicabilidade e baixo custo do método comparado com outras técnicas como espectrometria de massas. Para os três aminoácidos, L-valina, L-isoleucina e L-leucina, os limites de detecção encontrados foram: 1,61, 1,84 e 1,88 mmol L 1 e limites de quantificação 4,37, 6,13 e 6,27 mmol L 1, respectivamente.