Identificação e caracterização do estágio sexual de Plasmodium knowlesi utilizando análise bioinformática e parasitas transgênicos

Abstract

O objetivo deste trabalho foi criar linhagens repórter estáveis de Plasmodium knowlesi que facilitem o estudo das formas sexuadas e que permitam a execução de ensaios de ação de drogas mais eficientes. Para isso, efetuamos uma análise de dados gerados por scRNAseq, e escolhemos genes alvo para a edição genômica de P. knowlesi utilizando CRISPR/Cas9. Foram feitas três construções de DNA linear para a geração de três linhagens diferentes. A primeira é uma linhagem capaz de expressar a enzima bioluminescente NanoLuc constitutivamente, permitindo seu uso em ensaios de drogas para todas as fases do ciclo de vida do parasita. As outras duas linhagens devem expressar NanoLuc somente nos estágios sexuados (gametócitos), facilitando o estudo destas formas. Neste trabalho também apresentamos a análise de dados de sequenciamento de RNA de célula única de P. falciparum desenvolvida para identificar e caracterizar as formas sexuadas deste parasita. Isto permitiu a descoberta de novos genes e vias que podem ser usados como marcadores moleculares e como alvos de drogas e vacinas de bloqueio de transmissão. Essas análises identificaram um grupo intermediário de parasitas entre anéis sexualmente comprometidos e gametócitos de estágio I que não havia sido descrito anteriormente. Também foram identificados 32 novos genes de P. falciparum que têm potencial de serem utilizados como marcadores de gametócitos. Desses genes, a maior parte não tem função definida, abrindo espaço para estudos de caracterização e potencial desenvolvimento de novos métodos de boqueio de transmissão.

This study’s objective was to create stable reporter lineages of P. knowlesi that would allow the study of its sexual stage and improve the approach of new drug tests. Analysis of data generated by scRNAseq provided target genes for the genomic editing of P. knowlesi using CRISPR/Cas9. Three linear DNA constructs were made in order to generate three different lineages. The first one is be able to express the NanoLuc enzyme allowing its use in drug assays for all of the parasite’s life stages. The other two also expresses NanoLuc, but driven by a gametocyte gene’s promoter. That way the enzyme would only be expressed in that stage, facilitating the study of this stage. Furthermore, this study also focused on analyzing data from Single Cell RNA sequencing to identify and characterize the parasite’s sexual stage in order to promote studies of its sexual cycle and discover gene and pathways that might be used as markers for the study of transmission blocking drugs and vaccines. These analyzes identified an intermediary group between sexually committed rings and gametocyte I that hadn’t been previously described. It was also identified 32 new P. falciparum genes which have the potential of being used as gametocyte markers. The majority of those genes are of an unknown function, which opens way for studies to characterize them and identify their potential to help develop new transmission blocking methods.