Expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular em células endoteliais resistentes ao anoikis submetidas ao silenciamento gênico do sindecam-4

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Data
2023-08-08
Autores
Ferreira, Bianca Zaia Franco [UNIFESP]
Orientadores
Lopes, Carla Cristina [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Introdução e Objetivo: A remodelação da arquitetura do citoesqueleto durante o ciclo celular é crucial para uma divisão precisa. Apesar da importância do sindecam-4 (SDC4) em diversos eventos celulares, seu papel específico na desregulação do ciclo celular em células tumorais ainda não está completamente elucidado. Este trabalho buscou entender o papel do sindecam-4 na progressão e regulação do ciclo celular e no remodelamento do citoesqueleto em células endoteliais resistentes ao anoikis. Métodos: Células endoteliais selvagens (EC), EC resistentes ao anoikis (Adh1-EC), EC resistentes ao anoikis silenciadas para o gene do sindecam-4 (Adh-shRNA-Syn4-EC) e EC transfectadas com o oncogene EJ-ras (EJ-ras EC) foram estudadas em relação à expressão de proteínas reguladoras expressas nas diferentes fases do ciclo como: CDKs, ciclinas, os inibidores p21 e p27, além de algumas proteínas do citoesqueleto. A expressão proteica foi avaliada por meio das técnicas de Western Blotting e Citometria de Fluxo, enquanto a análise do RNAm foi conduzida utilizando a técnica de qPCR. Além disso, a localização das proteínas foi investigada por meio da técnica de imunofluorescência, e a viabilidade celular foi avaliada por meio de um ensaio de resistência ao anoikis. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando o programa GraphPad Prism 6, com valor de significância p<0,05. Resultados: O silenciamento gênico do sindecam-4 diminuiu a taxa de proliferação. Isso ocorreu por meio da alta expressão de p27 e baixa expressão do complexo ciclina E-CDK2, que impedem a célula de avançar ao ponto R em direção a fase S do ciclo celular, confirmado pela diminuição da ciclina B1. Conclusões: O silenciamento do sindecam-4 resultou em um aumento na suscetibilidade das células ao processo de anoikis, indicando que sua regulação pode representar um alvo terapêutico promissor. Essa descoberta evidencia a capacidade do sindecam-4 em modular os processos relacionados ao desenvolvimento do câncer, destacando sua relevância como um potencial alvo terapêutico no combate a essa doença.
Objective: The remodeling of the cytoskeletal architecture during the cell cycle is crucial for accurate division. Despite the importance of syndecan4 (SDC) in various cellular events, its specific role in the deregulation of the cell cycle in tumor cells is still not fully understood. This study aimed to understand the role of syndecam4 in cell cycle progression and regulation and in cytoskeletal remodeling in anoikisresistant endothelial cells. Methods: Wildtype endothelial cells (EC), anoikisresistant EC (Adh1EC), syndecan4 genesilenced anoikisresistant EC (AdhshRNASyn4EC), and EC transfected with the EJras oncogene (EJras EC) were studied in relation to expression of regulatory proteins expressed in different phases of the cell cycle, such as CDKs, cyclins, p21 and p27 inhibitors, and some cytoskeletal proteins. Protein expression was assessed using Western Blotting and Flow Cytometry techniques, while mRNA analysis was conducted using the qPCR technique. Additionally, protein localization was investigated through the immunofluorescence technique, and cell viability was evaluated through an anoikis resistance assay. The obtained data were statistically analyzed using GraphPad Prism 6 software, with a significance level of p<0.05. Results: Gene silencing of syndecam4 decreased the proliferation rate. This was achieved through the upregulation of p27 and downregulation of the cyclin ECDK2 complex, which hinder the cell from progressing to the R point towards the S phase of the cell cycle, as confirmed by the reduction of cyclin B1. Conclusions: Silencing of syndecam4 resulted in an increased susceptibility of cells to anoikis, indicating that its regulation could represent a promising therapeutic target. This discovery underscores the ability of syndecam4 to modulate processes related to cancer development, emphasizing its significance as a potential therapeutic target in the fight against this disease.
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