Caracterização molecular de Klebsiella pneumoniae resistentes às cefalosporinas de espectro estendido e aos carbapenêmicos: uma interface de Saúde Única

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Data
2023-06-26
Autores
Apolinário, Ruanita Veiga Queiroz [UNIFESP]
Orientadores
Gales, Ana Cristina [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
O conceito de “Saúde Única” baseia-se na noção de que a saúde humana, animal e ambiental está intimamente conectada e dependente mutuamente. A Klebsiella pneumoniae, além de colonizar humanos, está presente em diversos hospedeiros e nichos ecológicos como água, solo, plantas e animais. É considerada uma fonte e reservatório de genes de resistência, pelo fato de que, vários genes de resistência antimicrobiana de importância clínica foram descritos pela primeira vez nesta espécie. Sua plasticidade genômica e sua ampla gama ecológica permitem à Klebsiella pneumoniae adquirir, acumular e disseminar facilmente genes de resistência. O objetivo principal deste trabalho foi realizar a caracterização fenotípica e molecular de isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes às cefalosporinas de espectro estendido e/ou carbapenêmicos obtidas de diferentes regiões, hospedeiros e nichos ecológicos, a fim de auxiliar na compreensão da distribuição destes microrganismos no Brasil sob a perspectiva de Saúde Única (One Health). Foram coletadas amostras de fezes de humanos da população urbana e rural, swab retal ou cloacal de bovinos, frangos de corte, galinhas (aves) e suínos, amostras de água e solo de propriedades rurais e isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae em seis estados brasileiros. Para triagem as amostras foram semeadas em caldo TSB com ceftazidima, ceftriaxona, meropenem (2 µg/mL) e vancomicina (4 µg/mL). Após incubação, as amostras foram semeadas em ágar cromogênico e os isolados obtidos foram identificados pela técnica de MALDI-TOF MS. Os isolados tiveram suas concentrações inibitórias mínimas (CIMs) determinadas para cefalosporinas de espectro estendido e carbapenêmicos, seguindo as recomendações do BrCAST/EUCAST. Para os isolados que apresentaram resistência a estes antimicrobianos, foi realizada a pesquisa de genes que codificam β-lactamases (blaSHV-like, blaTEM-like, blaGES-like, blaCTX-M-1/2-like, blaKPC-like, blaNDM-like, blaIMP-like, blaVIM-like, blaGIM-like, blaSIM-like, blaBKC-like, blaOXA-1-like, blaOXA-2-like, blaOXA-5-like, blaOXA-7/10-like, blaOXA-45-like, blaOXA-46-like e blaOXA-48-like) e determinado seu perfil de similaridade genética por PFGE. Foram coletadas um total de 958 amostras, que após processamento originou 4.383 isolados bacterianos de diferentes espécies. Destes, 318 foram identificados como Klebsiella pneumoniae, sendo 141 (44,33%) sensíveis, 93 (29,24%) resistentes às β-lactamases de espectro estendido e 84 (26,41%) resistentes aos carbapenêmicos. Dos genes codificadores de β-lactamases identificados nos isolados resistentes (N=177), a maior frequência foi do gene blaCTX-M-1/2-like (N=107; 60,45%), seguido pelos genes blaOXA-1-like (N=103; 58,19%), blaTEM-like (N=95; 53,67%), blaKPC-like (76; 42,93%), blaCTX-M-8-like (8; 4,51%), blaCTX-M-14-like (6; 3,38%), blaNDM-like (6; 3,38%), blaOXA-5-like (2; 1,12%) e blaOXA-2-like (1; 0,56%). Observamos uma alta frequência (38,98%) de isolados carreando o contexto genético blaSHV-like, blaTEM-like, blaCTX-M-1/2-like e blaOXA-1-like. Na análise da similaridade genética por PFGE dos isolados recuperados de todos os centros participantes, observamos dois clusters (OH11 e OH21) que agruparam isolados de diferentes regiões, hospedeiros e/ou nichos ecológicos que apresentaram esse mesmo contexto genético. Um isolado clínico recuperado do serviço de saúde do centro de Dourados (MS) com um isolado recuperado de amostras de solo do centro de Castanhal (PA) e um isolado recuperado de amostras de água do centro de Bragança Paulista (SP) com um isolado recuperado de amostras de solo do centro de Castanhal (PA). As análises genômicas realizadas em isolados escolhidos que carreavam esse contexto, mostraram uma alta similaridade dos contigs carreando o gene blaCTX-M-15 e blaOXA-1, os genes estavam em um plasmídeo IncFIB e os clones pertenciam ao clone emergente ST307. Assim, mostramos que clones de Klebsiella pneumoniae com contextos genéticos semelhantes circulam entre diferentes regiões, hospedeiros e nichos ecológicos. Confirmando o papel do solo, águas superficiais e animais de produção como veículos disseminadores de genes de resistência de importância clínica, por apresentarem clones semelhantes com isolados clínicos recuperados neste projeto. Descrevemos também pela primeira vez o gene blaKPC-like e blaOXA-2-like em um suíno. Por fim, destacamos o clone emergente ST307, carreando o contexto blaTEM-like, blaCTX-M-15 e blaOXA-1, como uma nova ameaça à saúde pública no Brasil, tornando a Klebsiella pneumoniae um importante patógeno a ser monitorado pelos programas de vigilância no Brasil sob uma perspectiva de Saúde Única.
The concept of "One Health" is based on the notion that human, animal and environmental health are closely connected and mutually dependent. Klebsiella pneumoniae, in addition to colonizing humans, is present in diverse hosts and ecological niches such as water, soil, plants, and animals. It is considered a source and reservoir of resistance genes because several antimicrobial resistance genes of clinical importance have been described for the first time in this species. Its genomic plasticity and wide ecological range allow Klebsiella pneumoniae to easily acquire, accumulate and disseminate resistance genes. The main objective of this work was to perform the phenotypic and molecular characterization of Klebsiella pneumoniae isolates resistant to extendedspectrum cephalosporins and/or carbapenems obtained from different regions, hosts, and ecological niches in order to aid in the understanding of the distribution of these microorganisms in Brazil from a One Health perspective. Stool samples were collected from urban and rural population, rectal or cloacal swab from cattle, broilers, chickens (poultry) and pigs, water and soil samples from rural properties, and clinical isolates of Klebsiella pneumoniae in six Brazilian states. Samples were seeded in TSB broth with ceftazidime, ceftriaxone, meropenem (2 μg/mL) and vancomycin (4 μg/mL) for screening. After incubation, the samples were seeded on chromogenic agar and the isolates obtained were identified by MALDITOF MS technique. The isolates had their minimum inhibitory concentrations (MICs) determined for extended spectrum cephalosporins and carbapenems, following the BrCAST/EUCAST recommendations. For isolates that showed resistance to these antimicrobials, a search for genes encoding βlactamases (blaSHVlike, blaTEMlike, blaGESlike, blaCTXM1/ 2like, blaKPClike, blaNDMlike, blaIMPlike, blaVIMlike, blaGIMlike, blaSIMlike, blaBKClike, blaOXA1like, blaOXA2like, blaOXA5like, blaOXA7/ 10like, blaOXA45like, blaOXA46like, and blaOXA48like) and determined their genetic similarity profile by PFGE. A total of 958 samples were collected, which after processing yielded 4,383 bacterial isolates from different species. Of these, 318 were identified as Klebsiella pneumoniae, of which 141 (44.33%) were susceptible, 93 (29.24%) were resistant to extendedspectrum βlactamases, and 84 (26.41%) were resistant to carbapenems. Of the genes encoding βlactamases identified in the resistant isolates (N=177), the highest frequency was of the blaCTXM1/ 2like gene (N=107; 60.45%), followed by the blaOXA1like genes (N=103; 58.19%), blaTEMlike (N=95; 53.67%), blaKPClike (76; 42.93%), blaCTXM8like (8; 4.51%), blaCTXM14like (6; 3.38%), blaNDMlike (6; 3.38%), blaOXA5like (2; 1.12%), and blaOXA2like (1; 0.56%). We observed a high frequency (38.98%) of isolates carrying the blaSHVlike, blaTEMlike, blaCTXM1/ 2like, and blaOXA1like genetic background. In the PFGE genetic similarity analysis of isolates recovered from all participating centers, we observed two clusters (OH11 and OH21) that grouped isolates from different regions, hosts, and/or ecological niches that showed this same genetic context. A clinical isolate recovered from the health service of the center of Dourados (MS) with an isolate recovered from soil samples from the center of Castanhal (PA) and an isolate recovered from water samples from the center of Bragança Paulista (SP) with an isolate recovered from soil samples from the center of Castanhal (PA). Genomic analyses performed on selected isolates carrying this context showed a high similarity of the contigs carrying the blaCTXM15 and blaOXA1 gene, the genes were on an IncFIB plasmid and the clones belonged to the emerging clone ST307. Thus, we show that Klebsiella pneumoniae clones with similar genetic backgrounds circulate among different regions, hosts and ecological niches. Confirming the role of soil, surface water and farm animals as disseminating vehicles for resistance genes of clinical importance, by presenting similar clones with clinical isolates recovered in this project. We also described for the first time the blaKPClike and blaOXA2like gene in a pig. Finally, we highlight the emerging clone ST307, carrying the blaTEMlike, blaCTXM15 and blaOXA1 context, as a new public health threat in Brazil, making Klebsiella pneumoniae an important pathogen to be monitored by surveillance programs in Brazil under a One Health perspective.
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