Análise molecular do tráfego intracelular do canal para prótons sensível à voltagem por microscopia de fluorescência

Nenhuma Miniatura disponível
Data
2021
Autores
Silva, Luisa Ribeiro [UNIFESP]
Orientadores
Miranda Filho, Manoel de Arcisio [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Voltage-gated proton channel presents a physiological role of great importance to phagocytosis and sub sequential death of microorganisms in phagocytic cells, such as neutrophils and microglia. Recently various studies described the contribution of this channel in a higher malignity of tumors and its proliferation. Additionally, HV1 channels have been related to augmented tissue damage in cerebral stroke. Even though these pathological processes have been associated with a higher superficial expression of HV1 channels, little is known about how their abundance in the plasma membrane is regulated. Thus, in this work we have studied the molecular mechanisms of HV1 channel’s intracellular trafficking, and the relevance of cytoskeleton to its transport and function. Through advanced microscopy techniques, we showed that when overexpressed in a heterologous expression system, CHO-K1 cells, the channels are present diffuse in the plasma membrane and aggregated in vesicles in the region close to the plasma membrane. The movement of these vesicles containing HV1 was characterized for the first time in literature, as well as their fusion to the plasma membrane through kiss-and-run and/or kiss-and-linger mechanisms. Furthermore, high-resolution microscopy analysis of HV1 intracellular localization through co-transfection with 8 different intracellular organelles markers fused with EGFP resulted in a co-localization with caveolae, secretory pathway, late endosome, and recycling endosome. However, only the association with the recycling endosome was evident after dynamic co-localization analysis. The functional relationship between cytoskeleton and HV1 channels was analyzed using disruptive agents of microtubules and actin. Actin depolymerization resulted in a reduction of the density of activation and deactivation currents and diminished time to half peak of activation currents. The same effects were observed with microtubule depolymerization along with a higher activation voltage. On the other hand, cytoskeleton disruption did not arise alterations in the superficial expression and mobility of the channel, except for a lower diffusion coefficient with the loss of microtubules. Overall, these results suggests that HV1 channels are associated with recycling endosomes and are functionally modulated by both components of the cytoskeleton.
O canal para prótons sensível à voltagem (HV1) apresenta um papel fisiológico de suma importância para a fagocitose e subsequente morte de microorganismos em células fagocíticas. Além disso, diversos estudos descrevem a contribuição desse canal na maior malignidade e proliferação de tumores. Logo, o canal HV1 vem sendo estudado como um novo potencial alvo terapêutico. Apesar desses processos patológicos estarem associados a uma maior expressão superficial do canal HV1 pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares de regulação dessa abundância na membrana plasmática. Portanto, neste trabalho investigamos os mecanismos moleculares do tráfego intracelular do canal HV1, e a relevância do citoesqueleto para seu transporte e função. Por meio de técnicas avançadas de microscopia demonstramos que quando superexpressos em células CHO-K1 os canais se encontram difusos na membrana plasmática e agregados em vesículas na região próxima à membrana plasmática. A movimentação dessas vesículas contendo HV1 foi caracterizada, assim como sua fusão com a membrana plasmática pelo mecanismo de kiss-and-run/kiss-and-linger. Ainda mais, examinamos a localização intracelular do canal HV1 através da co-transfecção com oito diferentes marcadores de estruturas intracelulares, revelando sua relação com cavéolas, via secretória, lisossomo, endossomo tardio e endossomo de reciclagem. Porém, apenas sua associação com o endossomo de reciclagem se mostrou evidente após análise da co-localização dinâmica. Avaliamos a relação funcional do citoesqueleto com o canal HV1 com o uso de agentes disruptivos de microtúbulos e actina. A despolimerização de actina resultou na redução da densidade das correntes de ativação e deativação e na diminuição do tempo para atingir metade da corrente de ativação máxima. Os mesmos efeitos foram observados com a despolimerização de microtúbulos acrescidos de uma voltagem de ativação mais alta. No entanto, a disrupção do citoesqueleto não levou a alterações na expressão e mobilidade superficial do canal, excetuando um coeficiente de difusão menor com a perda de microtúbulos. Dessa maneira, concluímos que os canais HV1 estão associados com endossomos de reciclagem e são modulados funcionalmente por ambos os componentes do citoesqueleto.
Descrição
Citação