Vesículas extracelulares e Doença de Chagas crônica: fisiopatologia e biomarcadores

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Data
2021
Autores
Souza, Rafael Pedro Madeira Da Silva [UNIFESP]
Orientadores
Torrecilhas, Ana Claudia Trocoli [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Introduction. Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer envelopes whose contents reflect their cell of origin as well as possible cell targets in the organism. Their composition, in addition to their presence in virtually all body fluids, make them ideal for biomarker research and development. Chagas Disease, a neglected tropical disease caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi, is a major public health problem initially in Latin America, but now infected individuals can be found in several countries in Europe, Asia and North America. Objectives. Our work proposed establishing a protocol for circulating EV isolation in this population, the characterization of these EVs as well as their immunomodulatory potential in mononuclear cells. Methods. After collecting blood in heparin, EDTA, citrate and no anticoagulant, we isolated PBMC by density centrifugation and EVs by ultracentrifugation. In parallel, we characterized the EVs by scanning electron microscopy and nanoparticle tracking analysis. Quantification of cytokines present in the supernatant, as well as parasite molecules in EVs, were assessed by ELISA. Results. We observed that the choice of anticoagulants did not interfere with yield and relative purity of the EV isolate. Patients with Chagas disease released less EVs in vitro and had less circulating EVs in vivo. Macrophages released IFN-g and IL-17 when stimulated with patients’ EVs which correlated to different clinical stages of chronic disease. EVs from immunosuppressed patients have different size, concentration and composition. Conclusion. EVs have an important role on Chagas disease pathophysiology and a strong candidate for biomarker in chronic Chagas Disease.
Introdução. Vesículas Extracelulares são formados por uma bicamada lipídica cujo conteúdo reflete a célula de origem assim como possíveis células alvo no organismo. Sua composição, em conjunto com sua presença em quase todos os fluidos corpóreos, as tornam ideais para pesquisas e desenvolvimento de biomarcadores. A Doença de Chagas, uma doença tropical negligenciada causada pelo parasito protozoário Trypanosoma cruzi, é um importante problema de saúde pública inicialmente na América latina, mas atualmente encontram-se indivíduos infectados em vários países da Europa, Ásia e América do Norte. Objetivos. Nosso trabalho teve como objetivo estabelecer um protocolo para isolar as EVs circulantes assim como caracterizar e avaliar seu potencial imunomodulatório nas células mononucleares. Métodos. Após a coleta de sangue em heparina, EDTA, citrato e nenhum anticoagulante, isolamos PBMC por densidade e EVs por ultracentrifugação. Em paralelo caracterizamos as EVs por microscopia eletrônica de varredura e análise de rastreamento de nanopartículas. A dosagem de citocinas foi realizada no sobrenadante, assim como moléculas do parasito nas EVs, foram avaliados por ELISA. Resultados. Observamos que os anticoagulantes não interferem na obtenção das EVs circulantes. As amostras dos pacientes liberam menos EVs in vitro e menos EVs circulantes in vivo. Macrófagos produziram IFN-g e IL-17 quando estimulados com EVs isoladas dos pacientes que foram associadas à diferentes formas clínicas da doença crônica. EVs isoladas das amostras dos imunossuprimidos têm tamanho, concentração e composição diferentes. Conclusões. EVs têm papel importante na fisiopatologia da doença de Chagas e são candidatas a biomarcador na Doença de Chagas crônica.
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