Clonagem, expressão em células humanas HEK293 e caracterização de uma proteína recombinante multimérica correspondente ao domínio de ligação ao receptor da proteína Spike do SARS-CoV-2

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Data
2023
Autores
Lima, Verônica Aparecida de [UNIFESP]
Orientadores
Schenkman, Sergio [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
A doença COVID-19 responsável pela pandemia causada pelo vírus SARS-CoV-2 deixou mais de 6,6 milhões de mortes no mundo. O vírus SARS-CoV-2 é um betacoronavírus que pertence a família coronaviridae, possui aproximadamente 80% de similaridade com SARS-CoV, 51,8% com MERS-CoV e aproximadamente 96,2% com SARS-CoV de morcego RaTG13. O SARS-CoV-2 possui quatro proteínas estruturais e dezesseis proteínas não estruturais. A proteína S é uma das proteínas estruturais exposta na sua superfície e é o principal alvo para produção de vacinas e de anticorpos neutralizantes por conter o domínio de ligação ao receptor (RBD) responsável pela entrada do vírus em células humanas. A proteína S forma no vírus um trímero que é capaz de se ligar enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) promovendo a internalização da partícula viral pela célula. A maioria dos estudos de interação da porção RBD com o receptor tem sido feita com o fragmento monomérico contendo esta porção. Neste estudo expressamos em células HEK293 de maneira constitutiva e estável uma proteína recombinante contendo uma sequência sinal de imunoglobulina, a porção RBD seguida de uma região indutora de trimerização do bacteriófago T4 e uma sequência de 6 histidinas. Neste trabalho descrevemos a expressão da proteína e sua liberação no sobrenadante das células HEK293. A proteína foi purificada por coluna de Ni-agarose e cromatografia de exclusão e apresentou uma massa molecular de 135 kDa com uma estrutura secundária semelhante ao RBD monomérico. Análise em eletroforese em gel de poliacrilamida e SDS com e sem redutores foram compatíveis com a existência da forma de uma proteína multimérica, apresentando-se como trímeros e hexâmero identificados após “crosslinking”. A proteína purificada foi reconhecida pelo receptor ACE2 e gerou anticorpos com altos títulos (1:10000) em camundongos com a capacidade de inibir a ligação de ACE2-biotinilada à subunidade S1 e neutralizar a entrada do vírus, principalmente da linhagem Wuhan em células. Estes resultados agregam ao arsenal de combate à COVID-19, um possível imunógeno ou antígeno para diagnóstico.
COVID-19 disease was responsible for the pandemic caused by the SARS-CoV-2 virus, and it has left more than 6.3 million deaths worldwide. The SARS-CoV-2 virus is a beta coronavirus that belongs to the coronaviridae family, has approximately 80% similarity with SARS-CoV, 51.8% with MERS-CoV and approximately 96.2% with RaTG13 bat SARS-CoV. SARS-CoV-2 has four structural proteins and sixteen non-structural proteins. S-protein is one of the structural proteins exposed on the virus surface and is the main target for the production of neutralizing antibodies and vacines. It contains the virus receptor binding domain of human cells (RBD) responsible for virus entry into human cells. The S-protein forms in the virus a trimer that is able to bind the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) promoting the internalization of the viral particle by the cell. Most studies of interaction of the RBD with the receptor have been done with the monomeric fragment. In the present study we expressed in HEK293 cells a recombinant protein containing a signal sequence of immunoglobulin, the RBD part followed by a region responsible for the trimerization inducer of the bacteriophage T4 and a sequence of 6 histidines in a constitutive and stable manner. We showed the protein is produced and released in the culture supernatant of HEK293 cells. It was purified by Ni-agarose column and exclusion chromatography and a molecular mass of 135 kDa with a secondary structure similar to monomeric RBD. Electrophoresis analysis in polyacrylamide gel and SDS with and without reducing agents indicated that it forms multimeric structure composed by trimers and hexamers as identified by crosslinking. The purified protein was able to bind the ACE2 receptor and generated high antibody titers in mice (1:10000), capable on binding to ACE2 receptor. The antibodies were able to inhibit biotin labeled ACE2 binding to the virus S1 subunit and to neutralize the entry of the Wuhan virus strain into cells. These results added new arsenal to combat COVID-19, as a possible immunogen or antigen for diagnosis.
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