A liberação de moléculas de superfície gp82 e gp90 pelas formas metacíclicas do Trypanosoma cruzi é regulada por fosfolipase C e o arranjo de esteróis na membrana e modula o processo de invasão celular

Abstract

Os tripomastigotas metacíclicos de Trypanosoma cruzi liberam as moléculas de superfície gp82 e gp90 no meio extracelular, tanto na forma solúvel quanto na forma associada a vesículas. Essas glicoproteínas estágio-especificas estão envolvidas na invasão da célula hospedeira. O objetivo geral desta tese é elucidar os mecanismos de liberação de gp82 e gp90 pelos parasitas e determinar a influência das moléculas liberadas no processo de invasão da célula hospedeira. Durante a interação de células HeLa com a cepa G, que é pouco invasiva, foi detectada a liberação de gp82 e gp90 na forma de vesículas, enquanto na interação com a cepa CL, que é bastante invasiva, tal liberação não foi observada. A análise por microscopia confocal revelou uma distribuição diferenciada de gp82 e gp90 na superfície das cepas G e CL, que se distinguem morfologicamente. O perfil proteico dos meios condicionados das cepas G e CL foi similar, mas em experimento de western blotting foi detectada grande diferença no conteúdo de gp82 e gp90 entre as cepas, com expressão muito maior de ambas as proteínas na cepa G. Em ensaios de invasão celular, a presença de meio condicionado da cepa G reduziu significativamente a invasão da cepa CL. A depleção de gp82 no meio condicionado da cepa G, utilizando beads magnéticas ligadas a anticorpo monoclonal específico, aumentou o efeito inibitório na internalização da cepa CL, ao contrário do meio depletado em gp90. O efeito da droga depletora de colesterol, metil-β-ciclodextrina, sobre a liberação de gp82 e gp90 pela cepa G foi examinado. O meio condicionado dos parasitas tratados com a droga apresentou em western blot níveis aumentados de gp82 e gp90, e seu efeito inibitório da invasão da cepa CL foi maior que o controle não tratado. A participação de fosfolipase C da cepa G na liberação de gp82 e gp90 foi também investigada. Redução na liberação de ambas glicoproteínas foi detectada após tratamento dos parasitas com um inibidor da atividade de fosfolipase C. Esses resultados contribuem para melhor compreensão dos mecanismos de liberação de gp82 e gp90 pelas formas metacíclicas de T. cruzi e do papel das moléculas liberadas no processo de invasão celular.

Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes shed the surface molecules gp82 and gp90 to the extracellular medium, either in soluble form or in vesicles. These stage-specific glycoproteins are involved in host cell invasion. The objective of this work is to elucidate the mechanisms of shedding of gp82 and gp90 by the parasites and to determine the influence of the released molecules on the process of host cell invasion. During interaction of HeLa cells with G strain, which is poorly invasive, shedding of gp82 and gp90 in vesicles was detected, whereas no such release by highly invasive CL strain was observed. Confocal microscopy analysis revealed a differentiated distribution of gp82 and gp90 on the surface of G and CL strains, which distinguish morphologically. The protein profile of conditioned medium from G and CL strains was similar, but in western blotting experiment a marked difference in the content of gp82 and gp90 between strains was detected, the expression of both proteins being much higher in G strain. In cell invasion assays, the presence of conditioned medium from G strain significantly reduced the CL strain invasion. Depletion of gp82 in G strain conditioned medium, using magnetic beads coupled to specific monoclonal antibody, increased the inhibitory effect on CL strain internalization, as opposed to the medium depleted in gp90. The effect of cholesteroldepleting drug, methyl-β-cyclodextrin, on shedding of gp82 and gp90 was examined. The conditioned medium from parasites treated with the drug presented in western blot increased levels of gp82 and gp90, and its inhibitory effect on CL strain invasion was higher than the non-treated control. Also investigated was the participation of phospholipase C on shedding of hp82 and gp90. Decrease in the release of both glycoproteins was detected upon treatment with an inhibitor of phospholipase C activity. These results contribute for a better understanding of the mechanisms of shedding of gp82 and gp90 by T. cruzi metacyclic forms and of the role played by the released molecules in the process of cell invasion.