Estudo da sinalização intracelular mediada por receptores estrogênicos na indução da autofagia em modelo celular de tauopatia

Abstract

A doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa associada ao envelhecimento de maior prevalência no mundo. Ela é mais frequente em mulheres do que homens, e existem evidências de que a terapia de reposição hormonal com estrógenos confere benefícios à perda de memória em mulheres na menopausa. Emaranhados neurofibrilares associados à agregação da proteína tau são observados em pacientes com DA. Um dos mecanismos celulares envolvidos na remoção desses agregados proteicos é a autofagia, uma via catabólica lisossomal capaz de degradar componentes citosólicos, como organelas disfuncionais e proteínas malformadas ou agregadas. Considerando este conjunto de dados, o objetivo principal deste estudo foi avaliar a modulação da via autofágica e a neuroproteção induzida pelo 17β-estradiol em modelos celulares de tauopatia. A modulação da via autofágica foi analisada por meio da análise dos marcadores LC3 II e p62 em células controle SH-SY5Y e em modelo de tauopatia (eGFP-tau WT ou P301L), utilizando o sistema de expressão induzível Tet-On e por meio a transfeccção transiete das SH-SY5Y com o plasmídeo mCherry-LC3. A viabilidade celular foi avaliada por meio dos ensaios de MTT e exclusão de PI. Além disso, os níveis da proteína eGFP-tau foram avaliados em células tratadas com 17β-estradiol e E2BSA. Os resultados demonstraram que o tratamento com 17β-estradiol aumenta os níveis e as pontuações da LC3 II em células SH-SY5Y transfectadas com o plasmídeo mCherry-LC3, indicando indução do processo de autofagia. O tratamento com o agonista do receptor de estrógeno ESR1 também induziu a autofagia, enquanto que o antagonista deste receptor reverteu este efeito mediado pelo 17β-estradiol, sugerindo a participação deste receptor no processo de autofagia. A ativação do sistema Tet-On e, consequentemente, a superexpressão da proteína tau reduziu a viabilidade celular. Além disso, as células eGFP-tau WT e P301L apresentaram uma capacidade reduzida de induzir a via autofágia sob um estimulo de privação nutricional. É importante destacar que o tratamento com 17β-estradiol aumentou a viabilidade celular, os níveis da LC3 II e o clearance da proteína tau fosforilada e total na linhagem superexpressando a tau WT. No entanto, na linhagem eGFP-tau P301L este hormônio reduziu os níveis de LC3 II e da proteína tau fosforilada, sendo que não alterou os níveis da proteína tau total superexpressa. Os efeitos do 17β-estradiol nestas linhagens foram semelhantes ao seu análogo impermeável a membrana plasmática, o E2BSA, sugerindo a participação dos receptores de membrana, e a ativação da via estrogênica não genômica na modulação da sinalização autofágica. Frente aos resultados obtidos, é possível concluir que o 17β-estradiol atua na indução da autofagia e que esta ativação tem um papel importante na degradação da proteína tau disfuncional, o que pode impedir a formação de emaranhados neurofibrilares característicos da DA e de outras tauopatias. Trata-se de um importante achado, que poderá direcionar novos alvos terapêuticos, bem como obter mecanismos de modulação da via estrogênica para o tratamento da DA.

Alzheimer's disease (AD) is the most prevalent aging-associated neurodegenerative disease in the world. It is more common in women than men and there is evidence that estrogen hormone replacement therapy provides benefits to memory loss in menopausal women. Neurofibrillary tangles associated with tau protein aggregation are observed in AD patients. One of the cellular mechanisms involved in the removal of these protein aggregates is autophagy, a lysosomal catabolic pathway that degrade cytosolic components such as dysfunctional organelles and malformed or aggregated proteins. Thus, the main objective of this study was to evaluate the neuroprotection of 17β-estradiol by modulation of autophagy pathway in tauopathy cell models. Autophagy pathway was analyzed by LC3 II and p62 markers in SH-SY5Y control cells and in a tauopathy model (eGFP-tau WT or P301L) using the Tet-On inducible expression system, and by transient transfection with mCherry-LC3 plasmid in SH-SY5Y. Cell viability was assessed by MTT and PI exclusion assays. In addition, eGFP-tau protein levels were evaluated in cells treated with 17β-estradiol. Results showed that treatment with 17β-estradiol increased LC3 II levels and punctas in SH-SY5Y cells transfected with mCherry-LC3, indicating induction of the autophagy. The estrogen receptor ESR1 agonist also induced autophagy, whereas its antagonist reversed the 17β-estradiol-mediated autophagy, suggesting the participation of this receptor in autophagy. The activation of the Tet-On system and, consequently, the overexpression of tau protein reduced the cell viability. Additionally, the eGFP-tau WT and P301L cells demonstrated a reduced ability to induce autophagy upon starvation. Noteworthy, the treatment with17β-estradiol increased cell viability, LC3 II levels and the clearance of phosphorylated and total tau protein in tau WT overexpressing cells. However, this hormone reduced LC3 II and did not alter the levels of total overexpressed tau in the eGPF-tau P301L cell line. The effects of 17β-estradiol on these cell lines were similar to E2BSA (an estrogen that is not permeable to the plasma membrane), suggesting the participation of membrane receptors in these effects and the activation of non-genomic estrogenic pathway. Thus, these results show that the autophagy induction mediated by 17β-estradiol has an important role in dysfunctional tau protein degradation to prevent the formation of neurofibrillary tangles, characteristic of AD and other tauopathies. These are promising results to create possible avenues in signaling modulation and for drug design to treat the patients with AD.