Aplicação de extratores verdes para obtenção de flavonoides da própolis vermelha

Abstract

Red propolis has been widely studied in recent years, mainly by their flavonoids, which are responsible for most of their biological actions. Red propolis was recently discovered in Brazil and it is derived from the species Dalbergia ecastophyllum, from the Leguminaceae family. There are some studies that have shown antiparasitic, antioxidant and anti-tumor activity of this natural product. In general, the main solvent used in the extraction of bioactive propolis is ethanol, however, in some regions of the world the consumption of this type of extract is not allowed for religious reasons, therefore, the objective of this work was to develop a new method for extraction of flavonoids from red propolis using ionic liquids (ILs) and / or eutectic solvents (SEs), in order to obtain a high performance extract in terms of flavonoids and antioxidant activity. For that, an experimental design (CCDR 23) and the response-surface methodology were used as a strategy to establish the best parameters for the obtation of an extract rich in flavonoids. Initially, four ILs were tested in this work: 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate ([C4mim][BF4]), 1-hexyl-3-methylimidazolium chloride ([C6mim]Cl), 1-butyl-3- chloride methylimidazolium ([C4mim]Cl) and 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate ([C4mim][PF6]), in addition to three eutectic solvents: Choline chloride - glycerol (CH-GLY), choline chloride - butanediol (CH- BUT) and choline chloride - levulinic acid (CH-LEV). For the extracts obtation, 0.5 g of red propolis were mixed with the solvents in a solid-liquid ratio of 1: 3 and subjected to extraction in 80% amplitude ultrasound equipment (equivalent to 400W of power) for 5 minutes, followed by centrifugation at 4700 rpm for 15 minutes. An ethanolic extract (70 and 95% v: v) was prepared using the same experimental conditions to compare yields. The quantification of the total flavonoids present in the extracts was performed using the method of Zhishen, Mengcheng and Jianming (1999) and the results expressed in rutin equivalent (RuE.g-1). The extract obtained with the IL [C6mim]Cl in 10: 1 concentration (p:v) presented the best better performance, with 581.06 mg RuE.g-1, so it was selected for CCDR 23, considering the responses: flavonoid yield and antioxidant activity. In the response surface methodology, the following variables were evaluated: extraction time (Tmin), number of extractions and probe power (W). In this way, four extractions with [C6min]Cl, under the operational conditions set at 3.3 minutes and 300W were able to extract 394.39 ± 36,30 mg RuE.g-1 of total flavonoids and generate 7595.77 ± 5.48 mg TE.g-1 of dry biomass of antioxidant activity. Then, the antimicrobial evaluation of the optimized extract of red propolis, which showed the growth inhibition of Staphylococcus aureus and Salmonella enteritidis. In this way, the work contributed to the production of extracts, alcohol-free, of high performance in terms of flavonoids and antioxidant activity in comparison with conventional solvents.

A própolis vermelha tem sido amplamente estudada nos últimos anos, principalmente pelos flavonoides, apontados como responsáveis por grande parte das suas ações biológicas. A própolis vermelha foi descoberta recentemente no Brasil e é derivada da espécie Dalbergia ecastophyllum, da família Leguminaceae. Alguns estudos demonstraram atividade antiparasitária, antioxidante e antitumoral desse produto natural. Em geral, o principal solvente utilizado nas extrações dos bioativos do própolis é o etanol, contudo, em algumas regiões do mundo o consumo desse tipo de extrato não é permitido por motivos religiosos, desta forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um novo método para extração dos flavonoides da própolis vermelha com aplicação de líquidos iônicos (LIs) e/ou solventes eutéticos (SEs), a fim de se obter um extrato de alta performance em termos de flavonoides e atividade antioxidante. Para isso foi utilizado o planejamento experimental (CCDR 23) e a metodologia de superfície de resposta como estratégia para estabelecer os melhores parâmetros para obtenção de um extrato rico em flavonoides. Inicialmente, quatro LIs foram testados 1-butil-3-metilimidazólio tetrafluoroborato ([C4mim][BF4]), cloreto de 1-hexil-3-metilimidazolio ([C6mim]Cl), cloreto de 1-butil-3-metilimidazolio ([C4mim]Cl) e 1-butil-3-metilimidazolio hexafluorofosfato ([C4mim][PF6]), além de três solventes eutéticos: Cloreto de colina – glicerol (CH-GLY), cloreto de colina – butanodiol (CH-BUT) e cloreto de colina – ácido levulínico (CH-LEV). Para obtenção dos extratos, 0,5 g de própolis vermelha foram misturados aos solventes numa proporção de sólido-líquido de 1:3 e submetidos a extração em equipamento ultrassom com 80% de amplitude (equivalente a 400 W de potência) por 5 minutos, seguida de centrifugação a 4700rpm por 15 minutos. Um extrato etanólico (70 e 95% v:v) foi preparado empregando as mesmas condições experimentais para efeito de comparação dos rendimentos. A quantificação dos flavonoides totais presentes nos extratos foi realizada empregando o método de Zhishen, Mengcheng e Jianming (1999) e os resultados expressos em equivalente de rutina (ERu.g-1). O extrato contendo o LI [C6mim]Cl na concentração 10:1 (p:v) obteve melhor performance, com 581,06 ± 20,97 mg ERu.g-1 e foi selecionado para o CCDR 23, com resposta em rendimento de flavonoides e atividade antioxidante, esta última, expressa em equivalente de Trolox (ET.g-1 de amostra). Na metodologia de superfície de resposta foram aplicadas as seguintes variáveis: tempo de extração (Tmin), número de extrações e potência da probe (W). Desta forma, quatro extrações com [C6mim]Cl, nas condições operacionais fixadas em 3,3 minutos e 300W foram capazes de extrair 394,39 ± 36,30 mg ERu.g-1 de flavonoides totais e gerar 7595,77 ± 5,48 mg ET.g-1 de biomassa seca em atividade antioxidante. Por fim, a avaliação antimicrobiana do extrato otimizado de própolis vermelha, levou a inibição do crescimento das bactérias Staphylococcus aureus e Salmonella enteritidis. Desta forma, o trabalho contribuiu para a produção de extratos, isentos de álcool, de alta performance em termos de flavonoides e atividade antioxidante em comparação com os solventes convencionais.