Síntese de inibidores de proteases: arilamidas derivadas de L-Cisteína e S-Nitrosotióis derivados

Abstract

Proteases are enzymes that cleave peptide bonds of different substrates, participating in multiple metabolic reactions in living beings. Some viruses like HIV relies on proteases for their reproductive cycle. The cleavage of certain essential proteins allows the activation of its ideal conformation and the replication of new virions. HIV-1 protease and renin are homologous aspartyl proteases that play important pathophysiological roles in the progression of AIDS and hypertension, respectively. In this context, these proteases are the main pharmacological targets for the drug design in the therapy of patients living with HIV/AIDS who might also have hypertension as an adverse effect of antiretroviral therapy. Structural and functional characteristics common between HIV-1 protease and renin led us to design new aryl amides, applying molecular simplification of the antiretroviral agent nelfinavir. Hence, the main goal of this work was to synthesize potential dual inhibitors for both proteases (renin and HIV-1 protease). In this context, the synthesis of two series of L-cysteine-derived arylamides using more sustainable methodologies were the aims of our study. The synthetic methodologies that used the coupling reagent CDI in neat conditions proved to be efficient and clean, with yields varying between 50% and 90%. Furthermore, S-nitrosothiols derived from arylamides were obtained in yields of approximately 95%, remaining stable in DMSO solution at -10°C. In vitro experiments were carried out with papain (cysteine-protease), β-trypsin (serine-protease) and pepsin (aspartic-protease), to evaluate the selectivity of these compounds facing the family of aspartyl-proteases. In general, the results obtained for the enzymatic assays revealed that the series 1 compounds protected with the trityl group showed low inhibition rates for all proteases. When unprotected, these compounds showed lower IC50 values, mainly for pepsin (between 0.67±0.04 and 3.98±0.06 µM), hence evidencing the importance of removing the protective group for the optimization of inhibitory activity. The S-nitrosothiols of the same series were noteworthy with IC50 values between 0.004±0.001 µM and 0.006±0.001 µM for pepsin. For arylamides of the second series, the results showed that the compounds are effective in inhibiting pepsin (IC50 between 0.19±0.02 µM and 1.00±0.05 µM) and trypsin (IC50 between 19.00±0.30 µM and 240±5.00 µM), but not papain. These preliminary trials illustrated the potential for inhibition of the synthesized compounds against the different types of proteases used.

Proteases são enzimas que quebram ligações peptídicas de diversos substratos, participando de várias reações metabólicas em seres vivos. Alguns vírus como o HIV dependem de proteases em seu ciclo reprodutivo. A clivagem de certas proteínas essenciais permite a ativação da conformação ideal das mesmas e a replicação de novos vírions. A HIV-1 protease e a renina são aspartil proteases homólogas que desempenham papéis fisiopatológicos importantes na evolução da AIDS e da hipertensão, respectivamente. Neste contexto, essas proteases são os principais alvos biológicos para o desenvolvimento de fármacos no tratamento de pacientes portadores de HIV/AIDS, os quais podem apresentar hipertensão como efeito adverso da terapia antirretroviral. Características estruturais e funcionais comuns entre a HIV-1 protease e a renina nos levaram a planejar novas arilamidas, utilizando a simplificação molecular do agente antirretroviral nelfinavir. Assim, o objetivo do trabalho foi sintetizar inibidores potenciais com dupla atividade em relação a estas proteases. Neste contexto, nosso estudou focou a síntese de duas séries de arilamidas derivadas de L-cisteína utilizando metodologias mais sustentáveis. As metodologias sintéticas que utilizaram o reagente de acoplamento CDI sem o uso de solventes orgânicos mostraram-se eficientes e limpas, em rendimentos variando entre 50% e 90%. Além disso, S-nitrosotióis derivados dessas arilamidas foram obtidos em rendimentos de aproximadamente 95%, permanecendo estáveis em solução de DMSO a -10°C. Ensaios in vitro foram realizados com a papaína (cisteinil-protease), β-tripsina (serinil-protease) e pepsina (aspartil-protease) com a finalidade de avaliar a seletividade desses compostos frente a família das aspartil-proteases. De forma geral, os resultados obtidos para os ensaios enzimáticos revelaram que os compostos da série 1 protegidos com o grupo tritila apresentaram baixa inibição para todas as proteases. Quando desprotegidos, esses compostos apresentaram menores valores de IC50 principalmente para a pepsina (entre 0,67±0,04 e 3,98±0,06 µM), evidenciando, assim, a importância da retirada do grupo protetor para a otimização da atividade inibitória. Os S-nitrosotióis dessa mesma série se destacaram com valores de IC50 entre 0,004±0,001 µM e 0,006±0,001 µM para a pepsina. Para as arilamidas da segunda série, os resultados mostraram que os compostos são efetivos na inibição da pepsina (IC50 entre 0,19±0,02 µM e 1,00±0,05 µM) e da tripsina (IC50 entre 19,00±0,30 µM e 240±5,00 µM), mas não da papaína. Estes ensaios preliminares demostraram o potencial de inibição dos compostos sintetizados frente aos diferentes tipos de proteases utilizados.