Seleção de fungos filamentosos como eficientes fontes de lignina-peroxidases
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Data
2020-08-21
Autores
Lima, Lidiane Maria Dos Santos [UNIFESP]
Orientadores
Vasconcellos, Suzan Pantaroto De [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Selection of Filamentous Fungi as Efficient Sources of Lignin-Peroxidases Lignin peroxidases (LiP) are ligninolytic enzymes normally produced by biodegradable fungi of lignocellulose in nature. Currently, interest in such enzymes has increased, due to their high potential for biotechnological application. In this sense, the search for microbial cultures, of different habitats, with different environmental conditions, exponentially increases the acquisition of notable enzymes for the most diverse purposes. An example is the application of biorefineries of cellulosic ethanol, which aims at the efficient transformation of lignocellulosic biomass into bioproducts, such as biofuels and energy, thus being considered a sustainable alternative to petroleum derivatives. However, one of the obstacles to the lignocellulose valorization on an industrial scale is the complexity and recalcitrance of biomass, especially lignin. It is in this context that the development and optimization of enzymatic preparations based on lignin-peroxidases are required, in order to enable the cleavage and digestibility of lignocellulosic fiber. Thus, the present study was initiated by the screening of environmental filamentous fungi with respect to the effectiveness of lignin-peroxidases, using dye degradation tests of aromatic molecular structures, such as remazol brilliant blue R (RBBR) and methylene blue (AM), as compounds for detecting fungal ligninolytic activity. Thus, six (6) filamentous fungi FPZSP3_01, FPZSP3_05, FPZSP3_47, FPZSP3_91, FPZSP1_129 and FPZSP1_141 isolated from soil increased by filter cake from sugar and alcohol refineries, were selected. Thus, such microorganisms were subjected to in-depth analysis about the enzymatic kinetics of their lignin-peroxidases, analyzing the crude enzymatic extract (microbial supernatant) from the following strains: FPZSP3_47 (Mucor sp.), FPZSP1_129 (Byssochlamys nivea) and FPZSP1 (Paecilomyces saturatus). The apparent kinetic constants KM, Vmax and kcat were determined in two conditions, pH 3.0 at room temperature (20 ºC±2), and pH 9.0, NaCl 4M, at 65 ºC, in addition to the influence of different temperatures, pH ranges and salinities in the activities enzyme detected. The filamentous fungus Mucor sp. (FPZSP3_47) belonging to the phylum Mucoromycota was selected for protein characterization studies. The apparent kinetic constants KM (mM) 55.65 ± 6.56, Vmax (mmol min-1) 414.75 ± 6.37 and kcat (min-1) 7.45 were higher at pH 3.0 at room temperature for Mucor sp. FPZSP3_47. The lignin-peroxidases of Mucor sp., Byssochlamys nivea and Paecilomyces saturatus exhibited activity and stability for 30 hours at all temperatures evaluated (4 ºC, ambient, 30 ºC and 65 ºC), with two optimal temperatures (30 ºC and 65 ºC) being selected. ºC). Such conditions were selected to analyze the activity dependence and enzymatic stability at pH. All ligninases of Mucor sp., Byssochlamys nivea and Paecilomyces saturatus were active and stable over a wide pH range (5.0 to 9.0). The pH 9.0 and the temperature of 65 ºC were selected to investigate the effect of NaCl (0.1 to 4 M) on the stability of LiP, and the results revealed wide tolerance to NaCl, for 24 hours. The LiP of the isolate Mucor sp. was purified by ion-exchange chromatography and analyzed on SDS-PAGE 12%, featuring a protein with a molecular mass estimated at 60 kDa and specific activity of 0.013 U/mg. It is worth mentioning that this is the first description of ligninases of a fungus of the genus Mucor sp. in the literature, therefore, a potential candidate for the optimization of processes associated with the production of ethanol from vegetable biomass.
Seleção de Fungos Filamentosos como Eficientes Fontes de Lignina-Peroxidases Lignina peroxidases (LiP) são enzimas ligninolíticas produzidas normalmente por fungos biodegradadores de lignocelulose na natureza. Atualmente, tem aumentado o interesse por tais enzimas, devido ao seu elevado potencial de aplicação biotecnológica. Nesse sentido, a busca por culturas microbianas, de habitats distintos, com condições ambientais diversas, aumenta exponencialmente a aquisição de notáveis enzimas para os mais diversos fins. Um exemplo é a aplicação em biorrefinarias de etanol celulósico, a qual almeja a transformação eficiente da biomassa lignocelulósica em bioprodutos, tais como biocombustíveis e energia, sendo assim considerada uma alternativa sustentável aos derivados do petróleo. No entanto, um dos obstáculos para a valorização da lignocelulose em escala industrial é a complexidade e recalcitrância da biomassa, especialmente a lignina. É nesse contexto que o desenvolvimento e a otimização de preparações enzimáticas à base de lignina-peroxidases são requeridas, de maneira a viabilizar a clivagem e digestibilidade da fibra lignocelulósica. Dessa maneira, o presente estudo foi iniciado pela triagem de fungos filamentosos ambientais no que tange à efetividade de lignina-peroxidases, fazendo uso de ensaios de degradação de corantes de estruturas moleculares aromáticas, tais como remazol brilliant blue R (RBBR) e azul de metileno (AM), como compostos de detecção da atividade ligninolítica fúngica. Assim, seis (6) fungos filamentosos FPZSP3_01, FPZSP3_05, FPZSP3_47, FPZSP3_91, FPZSP1_129 e FPZSP1_141 isolados de solo incrementado por torta de filtro de refinarias de açúcar e álcool, foram selecionados. Assim, tais microrganismos foram submetidos à análises aprofundadas acerca dos parâmetros cinético-enzimáticas de suas lignina-peroxidases, analisando-se o extrato enzimático bruto (sobrenadante microbiano) das seguintes linhagens: FPZSP3_47 (Mucor sp.), FPZSP1_129 (Byssochlamys nivea) e FPZSP1_141 (Paecilomyces saturatus). Foram determinadas as constantes cinéticas aparentes KM, Vmax e kcat em duas condições, pH 3,0 sob temperatura ambiente (20 ºC±2), e pH 9,0, NaCl 4 M, à 65 ºC, além da influência de diferentes temperaturas, faixas de pH e salinidades nas atividades enzimáticas detectadas. O fungo filamentoso Mucor sp. (FPZSP3_47) pertencente ao filo Mucoromycota foi selecionado para os estudos de caracterização proteica. As constantes cinéticas aparentes KM (mM) 55,65±6,56, Vmax (mmol min-1) 414,75±6,37 e kcat (min-1) 7,45 foram maiores em pH 3,0 à temperatura ambiente para Mucor sp. FPZSP3_47. As lignina-peroxidases de Mucor sp., Byssochlamys nivea e Paecilomyces saturatus exibiram atividade e estabilidade durante 30 horas em todas as temperaturas avaliadas (4 ºC, ambiente, 30 ºC e 65 ºC), tendo sido selecionadas duas temperaturas ótimas (30 ºC e 65 ºC). Tais condições foram selecionadas para analisar a dependência da atividade e estabilidade enzimática ao pH. Todas as ligninases de Mucor sp., Byssochlamys nivea e Paecilomyces saturatus foram ativas e estáveis em um amplo espectro de pH (5,0 a 9,0). O pH 9,0 e a temperatura de 65 ºC foram selecionados para investigar o efeito de NaCl (0,1 a 4 M) na estabilidade de LiP, sendo que os resultados revelaram ampla tolerância a NaCl, durante 24 horas. A LiP do isolado Mucor sp. foi purificada por cromatografia de troca-iônica e analisada em SDS-PAGE 12 %, caracterizando-se uma proteína com massa molecular estimada em 60 kDa e atividade específica de 0,013 U/mg. Vale ressaltar que esta é a primeira descrição de ligninases de um fungo do gênero Mucor sp. na literatura, portanto, um potencial candidato para a otimização de processos associados à produção de etanol a partir de biomassa vegetal.
Seleção de Fungos Filamentosos como Eficientes Fontes de Lignina-Peroxidases Lignina peroxidases (LiP) são enzimas ligninolíticas produzidas normalmente por fungos biodegradadores de lignocelulose na natureza. Atualmente, tem aumentado o interesse por tais enzimas, devido ao seu elevado potencial de aplicação biotecnológica. Nesse sentido, a busca por culturas microbianas, de habitats distintos, com condições ambientais diversas, aumenta exponencialmente a aquisição de notáveis enzimas para os mais diversos fins. Um exemplo é a aplicação em biorrefinarias de etanol celulósico, a qual almeja a transformação eficiente da biomassa lignocelulósica em bioprodutos, tais como biocombustíveis e energia, sendo assim considerada uma alternativa sustentável aos derivados do petróleo. No entanto, um dos obstáculos para a valorização da lignocelulose em escala industrial é a complexidade e recalcitrância da biomassa, especialmente a lignina. É nesse contexto que o desenvolvimento e a otimização de preparações enzimáticas à base de lignina-peroxidases são requeridas, de maneira a viabilizar a clivagem e digestibilidade da fibra lignocelulósica. Dessa maneira, o presente estudo foi iniciado pela triagem de fungos filamentosos ambientais no que tange à efetividade de lignina-peroxidases, fazendo uso de ensaios de degradação de corantes de estruturas moleculares aromáticas, tais como remazol brilliant blue R (RBBR) e azul de metileno (AM), como compostos de detecção da atividade ligninolítica fúngica. Assim, seis (6) fungos filamentosos FPZSP3_01, FPZSP3_05, FPZSP3_47, FPZSP3_91, FPZSP1_129 e FPZSP1_141 isolados de solo incrementado por torta de filtro de refinarias de açúcar e álcool, foram selecionados. Assim, tais microrganismos foram submetidos à análises aprofundadas acerca dos parâmetros cinético-enzimáticas de suas lignina-peroxidases, analisando-se o extrato enzimático bruto (sobrenadante microbiano) das seguintes linhagens: FPZSP3_47 (Mucor sp.), FPZSP1_129 (Byssochlamys nivea) e FPZSP1_141 (Paecilomyces saturatus). Foram determinadas as constantes cinéticas aparentes KM, Vmax e kcat em duas condições, pH 3,0 sob temperatura ambiente (20 ºC±2), e pH 9,0, NaCl 4 M, à 65 ºC, além da influência de diferentes temperaturas, faixas de pH e salinidades nas atividades enzimáticas detectadas. O fungo filamentoso Mucor sp. (FPZSP3_47) pertencente ao filo Mucoromycota foi selecionado para os estudos de caracterização proteica. As constantes cinéticas aparentes KM (mM) 55,65±6,56, Vmax (mmol min-1) 414,75±6,37 e kcat (min-1) 7,45 foram maiores em pH 3,0 à temperatura ambiente para Mucor sp. FPZSP3_47. As lignina-peroxidases de Mucor sp., Byssochlamys nivea e Paecilomyces saturatus exibiram atividade e estabilidade durante 30 horas em todas as temperaturas avaliadas (4 ºC, ambiente, 30 ºC e 65 ºC), tendo sido selecionadas duas temperaturas ótimas (30 ºC e 65 ºC). Tais condições foram selecionadas para analisar a dependência da atividade e estabilidade enzimática ao pH. Todas as ligninases de Mucor sp., Byssochlamys nivea e Paecilomyces saturatus foram ativas e estáveis em um amplo espectro de pH (5,0 a 9,0). O pH 9,0 e a temperatura de 65 ºC foram selecionados para investigar o efeito de NaCl (0,1 a 4 M) na estabilidade de LiP, sendo que os resultados revelaram ampla tolerância a NaCl, durante 24 horas. A LiP do isolado Mucor sp. foi purificada por cromatografia de troca-iônica e analisada em SDS-PAGE 12 %, caracterizando-se uma proteína com massa molecular estimada em 60 kDa e atividade específica de 0,013 U/mg. Vale ressaltar que esta é a primeira descrição de ligninases de um fungo do gênero Mucor sp. na literatura, portanto, um potencial candidato para a otimização de processos associados à produção de etanol a partir de biomassa vegetal.