Expressão heteróloga e avaliação in vitro da atividade de proteínas recombinantes de Haementeria vizottoi sobre os mecanismos de coagulação sanguínea, com foco em aplicação biotecnológica

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Data
2020-03-05
Autores
Linhares, Debora Do Carmo [UNIFESP]
Orientadores
Tavassi, Ana Marisa Chudzinski [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Salivary secretions from hematophagous animals have been an important source of proteins with biotechnological potential, since there are a number of protein inhibitors that can be isolated and used to modulate the action of enzymes of interest. Many of these inhibitors have evolved to specifically disable key proteases from their hosts, leading to delayed blood coagulation (anticoagulants) and minor immune response, providing the hematophagous with the conditions for successful feeding. Based on transcriptomics of salivary glands of the leech Haementeria vizottoi, were identified sequences of three genes whose predicted proteins have signatures of potential biological activity as protease inhibitors. The aim of this prospective study was to clone, express and characterize these three H. vizottoi derived proteins, namely: Hviz 1276 (hemerythrin-like), Hviz 78 (antistasin-like) and Hviz 340 (cystatinlike). Due to their structural characteristics, antistin and cystatin-like proteins were expressed in P. pastoris (Komagataella pastoris) and hemerythrin-like protein was expressed in E. coli. The proteins of interest were recovered from the supernatant medium or cell extract, and purified by molecular exclusion chromatography and / or affinity chromatography with different resins. To determine their effects on the coagulation cascade, activated thromboplastin time (aPTT) and prothrombin time (PT) were determined using diagnostic kits. Depending on the result, they were also evaluated for the potential to inhibit specific proteases such as FXa, thrombin, elastase, kallikrein, papain and cathepsin L. Hviz 1276 did not demonstrate the expected biological activity and its study was discontinued. The application of partially purified Hviz 78, in the order of 1 µmol/L, was enough to extend the intrinsic-initiated coagulation time by more than 700%. It is still necessary to work on the refinement of purification of this protein and to perform new function tests, since no specific inhibitory activity against any of the proteases tested was identified. The most promising results were obtained with Hviz 340, purified and identified as inhibitor of cysteine proteases papain and cathepsin L, for the latter with ki=7.9 nmol/L. This activity represents new opportunities to evaluate the potential of Hviz 340 as a modulator of cellular activity related to the immune response, possibly anti-inflammatory, since cathepsins are critical for antigen processing and presentation.
Secreções salivares de animais hematófagos tem sido fonte importante de proteínas com potencial biotecnológico, uma vez que estão presentes uma série de inibidores proteicos que podem ser isolados e utilizados para modular a ação de enzimas de interesse. Muitos destes inibidores evoluíram para bloquear especificamente proteases chave dos seus hospedeiros, levando ao retardo da coagulação sanguínea (anticoagulantes) e da resposta imunológica, oferecendo ao hematófago as condições para uma alimentação bem-sucedida. A partir do transcriptoma de glândulas salivares da sanguessuga Haementeria vizottoi, foram identificas as sequências de três genes cujas proteínas preditas apresentam assinaturas de potencial atividade biológica como inibidores de proteases. O objetivo deste estudo prospectivo foi clonar, expressar e caracterizar estas três proteínas derivadas de H. vizottoi, sendo elas: Hviz 1276 (hemerythrinlike), Hviz 78 (antistasin-like) e Hviz 340 (cystatin-like). Devido às características estruturais, as proteínas semelhantes à antistasinas e à cistatinas foram expressas em P. pastoris (Komagataella pastoris) e a proteína semelhante hemeritrinas foi expressa em E. coli. As proteínas de interesse foram recuperadas do meio sobrenadante ou extrato celular, e purificadas por meio de cromatografia de exclusão molecular e/ou cromatografia de afinidade com diferentes resinas. Para determinar os efeitos das mesmas sobre a cascata de coagulação, foram determinados na sua presença o tempo de tromboplastina ativada (APTT) e o tempo de protrombina (PT), utilizando kits de diagnóstico. Conforme o resultado, também foram avaliadas quanto ao potencial de inibir proteases específicas como FXa, trombina, elastase, calicreína, papaína e catepsina L. Hviz 1276 não apresentou atividade biológica esperada e seu estudo foi finalizado. A aplicação de Hviz 78 parcialmente purificada, na ordem de 1 µmol/L, foi suficiente para prolongar o tempo de coagulação iniciada pela via intrínseca em mais de 700 %. Ainda é necessário trabalhar no refinamento da purificação desta proteína e realizar novos testes de função, já que não foi identificada atividade inibitória específica contra nenhuma das proteases testadas. Os resultados mais promissores foram obtidos com Hviz 340, purificada e identificada como inibidora das cisteíno proteases papaína e catepsina L, para esta última com ki de 7,9 nmol/L. Esta atividade abre uma janela de oportunidade para avaliar o potencial de Hviz 340 como modulador da atividade celular relacionada à resposta imunológica, possivelmente anti-inflamatório, uma vez que as catepsinas são fundamentais para o processamento e apresentação de antígenos.
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