Estudo de sistemas para incorporação de aminoácidos não canônicos em proteínas recombinantes expressas em E. coli, e potencial de aplicação
Data
2020-05-28
Autores
Santos, Fellipe Bronze Dos 
Orientadores
Oliveira, Vitor Marcelo Silveira Bueno Brandao De
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
The incorporation of non-canonical amino acids in proteins is an increasingly useful and versatile tool, being carried out by global replacement or site-directed by the use of orthogonal pairs. It is being increasingly used to add new characteristics to proteins, in studies of microscopy, NMR or X-ray diffraction. In this work, we demonstrated the methodology of global substitution of a greater range of amino acids by modifications in the expression protocol, using vectors under T7 promoter. Where the methodology that verified the incorporation level around 80% of the 5-Hydroxy Tryptophan (BBRC).Was described the development of an orthogonal pair capable of bio-incorporating “bulk” tryptophan analogues such as 5-Bromo Tryptophan and 5- NO2 Tryptophan not incorporated by E. coli tryptophanyl-tRNA synthetase. Since Lactococcus lactis tryptophanyltRNA synthetase can incorporate such analogs, it was transferred to E. coli. The Tryptophan anticodon was replaced by the amber stop codon for loss of identity with the original codon. Tests have shown that L. lactis tryptophanyl-tRNA synthetase does not recognize E. coliTrp-tRNA, however, L. lactisTrp-tRNA is recognized by E. coli synthetase. It showed the use of bio-incorporated p-NO2- phenylalanine (pNF) residues in TimetOligopeptidase (TOP) through an orthogonal pair from Methanococcusjannaschii, in specific positions. Being used as a fluorescence suppressor probe for a specific tryptophan residue. For the formation of a FRET pair (Trp-pNF) to study conformational changes in TOP.
A incorporação de aminoácidos não canônicos em proteínas tem se mostrado uma ferramenta cada vez mais útil e versátil, sendo realizada por substituição global ou sítio dirigida pela utilização de pares ortogonais. Está sendo cada vez mais difundida para a adição de novas características a proteínas, em estudos de microscopia, RMN ou difração de Raios-X. Neste trabalho descrevemos alguns desafios para a utilização dos aminoácidos não canônicos (AANC) e análogos de aminoácidos. Demonstramos a metodologia de substituição global de uma maior gama de aminoácidos por modificações no protocolo de expressão, utilizando vetores sob promotor T7. Onde foi descrita a metodologia que verificou a incorporação em torno de 80% do 5-Hidroxi Triptofano (BBRC).Foi mostrado o desenvolvimento de um par ortogonal capaz de bio-incorporar análogos de triptofano “volumosos” como 5-Bromo Triptofano e 5-NO2Triptofano não incorporados pela triptofanil-tRNAsintetase da E. coli.Uma vez que a triptofaniltRNAsintetase de L. lactispode incorporar tais análogos, foi transferido para a E. coli o anticódon de triptofano substituído pelo códon de parada âmbar para a perda de identidade com o códon original do Triptofano. Testes mostraram que a triptofanil-tRNAsintetase de L. lactis não reconhece o Trp-tRNA de E. coli, porém, o Trp-tRNA de L. lactis é reconhecido pela sintetase de E. coli. Utilização de resíduos de p-NO2-fenilalanina (pNF) bio-incorporadosna TimetOligopeptidase (TOP) através de um par ortogonal proveniente de Methanococcusjannaschii, em posições específicas. Sendo utilizados como uma sonda supressora da fluorescência de um resíduo específico de triptofano através da formação de par FRET (Trp-pNF) para monitorar alterações conformacionais na TOP.
A incorporação de aminoácidos não canônicos em proteínas tem se mostrado uma ferramenta cada vez mais útil e versátil, sendo realizada por substituição global ou sítio dirigida pela utilização de pares ortogonais. Está sendo cada vez mais difundida para a adição de novas características a proteínas, em estudos de microscopia, RMN ou difração de Raios-X. Neste trabalho descrevemos alguns desafios para a utilização dos aminoácidos não canônicos (AANC) e análogos de aminoácidos. Demonstramos a metodologia de substituição global de uma maior gama de aminoácidos por modificações no protocolo de expressão, utilizando vetores sob promotor T7. Onde foi descrita a metodologia que verificou a incorporação em torno de 80% do 5-Hidroxi Triptofano (BBRC).Foi mostrado o desenvolvimento de um par ortogonal capaz de bio-incorporar análogos de triptofano “volumosos” como 5-Bromo Triptofano e 5-NO2Triptofano não incorporados pela triptofanil-tRNAsintetase da E. coli.Uma vez que a triptofaniltRNAsintetase de L. lactispode incorporar tais análogos, foi transferido para a E. coli o anticódon de triptofano substituído pelo códon de parada âmbar para a perda de identidade com o códon original do Triptofano. Testes mostraram que a triptofanil-tRNAsintetase de L. lactis não reconhece o Trp-tRNA de E. coli, porém, o Trp-tRNA de L. lactis é reconhecido pela sintetase de E. coli. Utilização de resíduos de p-NO2-fenilalanina (pNF) bio-incorporadosna TimetOligopeptidase (TOP) através de um par ortogonal proveniente de Methanococcusjannaschii, em posições específicas. Sendo utilizados como uma sonda supressora da fluorescência de um resíduo específico de triptofano através da formação de par FRET (Trp-pNF) para monitorar alterações conformacionais na TOP.