Caracterização da proteína parkina em espermatozoides murinos e sua influência no desenvolvimento embrionário

Abstract

Objetivo: Avaliar o papel da proteína Parkina na distribuição das mitocôndrias paternas após a fertilização in vitro. Métodos: Foram utilizados camundongos C57BL / 6 normais e nocaute para PARK2 para promover deleção da proteína Parkina. Dos machos foram coletados espermatozoides para a avaliação da função espermática (concentração, motilidade, fragmentação do DNA dos espermatozoides e atividade mitocondrial), e análise da ubiquitinação e presença de Parkina, além da coleta de espermatozoides para a fertilização in vitro. As fêmeas foram estimuladas com hormônios para a indução da ovulação e delas foram coletados os oócitos para a fertilização in vitro. Com a fertilização pretendeu-se avaliar a presença das mitocôndrias paternas nos embriões e se a ausência de Parkina gera déficit na degradação de mitocôndrias paternas pela via de degradação proposta. Resultados: Não foram observadas diferenças significativas quanto aos parâmetros seminais e funcionais dos espermatozoides em ambos os grupos (p>0,05). Identificamos a proteína Ubiquitina na peça intermediária e região acrossomal dos espermatozoides e a proteína Parkina em toda a extensão desta célula. Observou-se diminuição na intensidade de marcação das proteínas Ubiquitina e Parkina nos espermatozoides de machos nocaute (p<0,05). Quanto à segregação mitocondrial, observamos que ela é dependente do tempo após a fertilização e sofre efeito da mutação no gene da PARK2, onde a união dos gametas entre uma fêmea nocaute e um animal controle demonstrou maior déficit na degradação mitocondrial. Conclusões: A proteína Parkina está presente em todo o espermatozoide e a diminuição da sua expressão no oócito impacta negativamente a fertilização e a eliminação de mitocôndrias paternas no zigoto após a fertilização in vitro.

Objective: To evaluate the role of Parkin protein in the distribution of paternal mitochondria after in vitro fertilization. Methods: Normal (C57BL / 6) and PARK2 knock-out mice were used to promote Parkina deletion. Spermatozoa were collected from males for the evaluation of sperm function (sperm concentration, motility, DNA fragmentation and mitochondrial activity), and analysis of ubiquitination and presence of Parkin. In addition to sperm collection for in vitro fertilization. Females were stimulated with hormones to induce ovulation and oocytes were collected from them for in vitro fertilization. With fertilization, it was intended to evaluate the presence of paternal mitochondria in the embryos and if the absence of Parkin generates a deficit in the degradation of paternal mitochondria by the proposed degradation pathway. Results: No significant differences were observed regarding seminal and functional parameters of sperm in both groups (p>0,05). We identified the Ubiquitin protein in the midpiece and acrosomal region of the spermatozoa and the Parkin protein throughout this cell. A decrease in the intensity of labeling of Ubiquitin and Parkin proteins was observed in the sperm of knockout males (p<0,05). As for mitochondrial segregation, we observed that it is time-dependent after fertilization and is affected by the mutation in the PARK2 gene, where the union of gametes between a knockout female and a control animal showed a greater deficit in mitochondrial degradation. Conclusions: Parkin protein is present in all sperm and the decrease in its expression in the oocyte negatively impacts fertilization and the elimination of paternal mitochondria in the zygote after in vitro fertilization.