ATP sulfurilase: sua relação com o fator de transcrição Cys3 e a regulação da biossíntese dos aminoácidos sulfurosos em Cryptococcus neoformans

Abstract

C. neoformans é um fungo oportunista que acomete principalmente pacientes imunocomprometidos causando infecções letais como a meningite criptococócica. Em decorrência da resistência deste patógeno aos medicamentos atuais, da escassez de antifúngicos e de tratamentos ineficazes, o estudo sobre os mecanismos de virulência e as interações entre patógeno e hospedeiro são de grande importância médica. Os fungos são eucariotos, assim como os seus hospedeiros, tornando muito difícil a identificação de novos alvos farmacológicos que tenham alta toxidade seletiva. A via de síntese de aminoácidos sulfurosos é exclusiva das bactérias, plantas, parasitas e dos fungos, é de extrema importância para a sobrevivência de C. neoformans in vitro e in vivo e representa um potencial alvo de inibidores com alta toxicidade seletiva. Os mecanismos de regulação desta rota de biossíntese têm sido muito estudados, sendo que o fator de transcrição central, Cys3, controla a ativação de vários genes desta via biossintética. Nossos estudos anteriores de imunoprecipitação e espectrometria de massas apontaram que Cys3 faz parte de um complexo contendo duas fosfatases (calcineurina subunidade catalítica e regulatória e a fosfatase Gpp2), as quais foram confirmadas como sendo parte deste complexo regulatório. Uma quarta proteína, a ATP sulfurilase foi identificada, mas ainda não havia sido confirmada como participante deste complexo. A primeira etapa deste trabalho confirmou a hipótese de que a ATP sulfurilase codificada pelo gene MET3 interage fisicamente com a proteína Cys3 e com a subunidade regulatória da calcineurina (Cna1-ߡC) pela técnica de interação entre proteínas por duplo híbrido em S. cerevisiae. A segunda parte deste trabalho teve por objetivo deletar o gene MET3 na linhagem contendo a construção Gfp-Cys3. Foram feitos experimentos de deleção gênica, mas devido às restrições para o trabalho presencial durante a pandemia do Covid-19 não foi possível cumprir todos os objetivos propostos. Neste trabalho de conclusão de curso serão apresentados os resultados de deleção gênica e análise fenotípica dos transformantes obtidos por biolística e posteriormente por eletroporação usando o sistema CRISPR-Cas9.