O papel dos pirofosfatos de Inositol na modulação da resposta ao dano de DNA

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Data
2021-11-09
Autores
Jekabson, Rafaella [UNIFESP]
Orientadores
Cussiol, José Renato Rosa [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Objetivo: Analisar a influência dos metabólitos do inositol, especialmente dos pirofosfatos de inositol, na resposta ao dano de DNA na levedura Saccharomyces cerevisiae. Métodos: Foram geradas linhagens celulares modificadas para as proteínas Kcs1 e Opi1, uma pirofosfato de inositol quinase e um repressor transcricional da via de biossíntese de inositol respectivamente. Essas linhagens foram tratadas com os agentes genotóxicos Metanossulfonato de metila e Hidroxiuréia e o fenótipo foi analisado por diferentes métodos como ensaios de sensibilidade, análise por western blot de marcadores da DDR e dos níveis proteicos de Kcs1, viabilizando a investigação dos mecanismos de sensibilidade ao stress genotóxico. Resultados: Demonstramos que em condições de estresse genotóxico induzido por metanossulfonato de metila, há um aumento nos níveis proteicos de Kcs1, sendo que o mesmo não ocorre em linhagem opi1Δ. Também demonstramos que em células kcs1Δ há um atraso na progressão do ciclo celular, da recuperação após o estresse genotóxico e da ativação de Rad53, a quinase efetora da sinalização de dano ao DNA. Por último, mostramos que a deleção de Opi1 resgata o fenótipo de sensibilidade ao Metanossulfonato de metila e Hidroxiuréia de linhagem kcs1Δ. Conclusões: Kcs1 promove a estabilidade genômica por meio da síntese dos pirofosfatos de inositol. Além disso, os pirofosfatos de inositol são importantes para a progressão da replicação do DNA durante o estresse genotóxico, possivelmente através de uma regulação direta ou indireta de Rad53. Adicionalmente, o resgate da sensibilidade ao estresse genotóxico pela deleção de Opi1 em kcs1Δ pode sugerir que esse repressor transcricional modula a síntese de pirofosfatos de inositol de maneira independente de Kcs1.
Objective: To assess the influence of inositol metabolites, inositol pyrophosphates, in the DNA damage response using the budding yeast model Saccharomyces cerevisiae. Methods: Genetically modified cell lines were generated for the proteins Kcs1 and Opi1, an inositol pyrophosphate kinase and an inositol biosynthesis repressor, respectively. Such cell lines were then submitted to genotoxic stress induced by Methyl methanesulfonate and Hydroxyurea and the phenotype was assessed through different means such as viability assays, western blotting of DNA damage response markers and Kcs1 protein accumulation, enabling the investigation of underlying mechanisms of genotoxic stress sensitivity. Results: We demonstrated Kcs1 is accumulated in wild type cells after Methyl methanesulfonate treatment but not in opi1Δ. Additionally, the kcs1Δ cell line was established to have a delay in cell cycle progression, recovery after genotoxic stress as well as DNA damage response activation through Rad53 phosphorylation. Finally, the Methyl methanesulfonate and Hydroxyurea sensitivity phenotype present in opi1Δ and kcs1Δ cells is rescued in the double mutant opi1Δkcs1Δ. Conclusions: Kcs1 promotes genomic stability through pyrophosphate synthesis. Furthermore, inositol pyrophosphates play a role in DNA replication and cell cycle progression, possibly through direct or indirect regulation of the DDR kinase Rad53. Moreover, the genotoxic stress sensitivity rescue achieved through the knockout of Opi1 in kcs1Δ cells suggests Opi1 modulates inositol pyrophosphate synthesis independently of Kcs1.
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