Caracterização e análise comparativa de cepas de Escherichia coli uropatogênicas (UPEC) portadoras de marcadores de virulência de cepas diarreiogênicas

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Data
2021
Autores
Nascimento, Júllia Assis da Silva
Orientadores
Gomes, Tânia Aparecida Tardelli [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Algumas cepas de Escherichia coli apresentam genes que codificam fatores de virulência que permitem a colonização, invasão e o estabelecimento de doenças em seus hospedeiros. Cepas de E. coli que causam infecções intestinais são conhecidas como E. coli diarreiogênicas (DEC), enquanto as que causam infecções extraintestinais são denominadas E. coli patogênica extraintestinal (ExPEC) e estão associadas à meningite neonatal, sepse e infecção do trato urinário (ITU). A E. coli uropatogênica (UPEC) é a principal causa de ITU, tanto de origem comunitária quanto hospitalar, em todo o mundo. Algumas cepas de UPEC podem apresentar genes de virulência associadosa cepas de DEC, constituindo cepas híbridas, o que sugere que possam apresentar potencial para causar doenças intestinais ou extraintestinais mais graves. Porém, poucos estudos avaliaram as propriedades fenotípicas e genotípicas e o potencial patogênico de cepas híbridas. Este estudo objetivou analisar a ocorrência de cepas híbridas de UPEC emisolados de pacientes com diferentes tipos de ITU, em duas regiões geográficas, e caracterizá-los genotípica e fenotipicamente. Foram estudadas 636 cepas, isoladas entre agosto de 2018 e dezembro de 2020, em Mogi Guaçu e São Paulo, SP. Após confirmaçãoda espécie, os isolados foram submetidos à reação em cadeia da polimerase (PCR) para pesquisa de marcadores moleculares (genes) de diagnóstico dos diferentes patotipos de DEC, relacionados com produção de toxinas Shiga (stx1 e stx2), toxinas termolábil (LT, elt) e termoestável (ST, est), ativador transcricional de adesão agregativa (aggR), adesinaintimina (eae) e invasina (invE). Os isolados que apresentaram algum desses marcadores(cepas híbridas) foram analisados por PCR para classificação filogenética, ocorrência dos marcadores de uropatogenicidade de UPEC e de virulência de ExPEC e tiveram seu genoma sequenciado. As cepas híbridas foram avaliadas quantoà capacidade de interagir com células HeLa (adenocarcinoma cervical), HEK 293T (epitélio renal) e T24 (epitélio de bexiga), e de formar biofilme. Entre doze cepas híbridas identificadas, oito foram portadoras de aggR e quatro, de eae, sendo classificadas como UPEC/EAEC (E. coli enteroagregativa) e UPEC/aEPEC (E. coli enteropatogênica atípica), respectivamente. Essas cepas pertenceram aos filogrupos A (cinco cepas), B1 (quatro), B2 (um) e D (dois). A análise do genoma revelou uma grande diversidade, com83,3% (10) delas pertencendo a sorotipos e STs diferentes; três cepas apresentaram a mesma origem clonal, o mesmo ST (ST10) e sorotipo (O153:H2). Além disso, foram identificados, nas cepas híbridas, genes que codificam resistência a diferentes classes de antimicrobianos (blaTEM-1D, blaCTX-M-15, sul2, dfrA8, dfrA14 e dfrA17, tet(A), tet(B), mph(A), qnrS1, mdf(A), aac(3)-III e aph(3’’)-Ib. Todas as cepas híbridas aderiram às três linhagens celulares testadas. Em células HeLa, as oito cepas UPEC/EAEC produziram adesão agregativa (ou semelhante), característica de EAEC, enquanto as UPEC/aEPEC produziram o padrão de adesão característico de aEPEC (adesão localizada-like). Sete das cepas UPEC/EAEC produziram biofilme, enquanto as UPEC/aEPEC não o fizeram. Nossos achados contribuem para a compreensão da patogenicidade de cepas híbridas de UPEC e do seu potencial para colonizar diferentes locais no trato urinário e intestinos, além de permitirem o entendimento da epidemiologia das diferentes regiões, contribuindo para a adoção de medidas adequadas de prevenção e controle da doença.
Some strains of Escherichia coli have genes that encode virulence factors that contribute to colonization, invasion and establishment of diseases in their hosts. Strains of E. coli that cause intestinal infections are known as diarrheagenic E. coli (DEC), while those that cause extraintestinal infections are called extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) and are associated with neonatal meningitis, sepsis, and urinary tract infection (UTI). Uropathogenic E. coli (UPEC) is the main cause of UTI, both of community and hospital origin, worldwide. Some UPEC strains may havevirulence genes associated with DEC strains, constituting hybrid strains, suggesting that they can cause more severe intestinal or extraintestinal diseases. However, few studies have evaluated the phenotypic and genotypic properties and the pathogenic potential of hybrid strains. This study aimed to analyze the occurrence of hybrid strains of UPEC among isolates from patients with different types of UTI in two geographic regions and characterize them genotypic and phenotypically. A total of 636 strains, isolated between August 2018 and December 2020 in Mogi Guaçu and São Paulo, SP, were studied. Afterconfirming the species, the isolates were subjected to a polymerase chain reaction (PCR)to search for diagnostic molecular markers (genes) of the different pathotypes of DEC related to the production of Shiga toxins (stx1 and stx2), thermolabile toxins (LT) and stable (ST), aggregative adhesion transcriptional activator (aggR), intimin adhesin (eae) and invasin (invE). Isolates that presented any of these markers (hybrid strains) were analyzed by PCR for phylogenetic classification, the occurrence of UPEC uropathogenicity and ExPEC virulence (ExPEC+) markers, and had their genome sequenced. The hybrid strains were evaluated for their ability to interact with HeLa (cervical adenocarcinoma), HEK 293T (renal epithelium) and T24 (bladder epithelium) cells, and to form biofilm. Among twelve identified hybrid strains, eight carried aggR and four, eae, being classified as UPEC/EAEC (enteroaggregative E. coli) and UPEC/aEPEC (atypical enteropathogenic E. coli), respectively. These strains belonged to phylogroups A (five strains), B1 (four), B2 (one), and D (two), and the genome analysis revealed a great diversity, with 83.3% (10) of them belonging to differentserotypes and STs; three strains had the same clonal origin, the same ST (ST10) and serotype (O153:H2). In addition, genes encoding resistance to different classes of antimicrobials were identified in the hybrid strains (blaTEM-1D, blaCTX-M-15, sul2, dfrA8, dfrA14 and dfrA17, tet(A), tet(B), mph(A), qnrS1, mdf(A), aac(3)-III and aph(3'')- Ib. All hybrid strains adhered to the cell lines tested. In HeLa cells, the eight UPEC/EAEC strains produced aggregative adhesion (or similar), characteristic of EAEC, whereas UPEC/aEPEC produced the characteristic adhesion pattern of aEPEC (localized-like adhesion). Seven of the UPEC/EAEC strains produced biofilm, while UPEC/aEPEC did not. Our findings contribute to recognizing the pathogenicity of UPEC hybrid strains and their potential to colonize different locations in the urinary tract and intestines and allow an understanding of the epidemiology of different regions, contributing to the adoption of appropriate measures to prevent and control the disease.
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