Estabelecimento de um modelo celular para o screening de peptídeos relacionados a liberação de DNA mitocondrial e a ativação de vias inflamatórias
Data
2021-04-26
Autores
Rocha, Ana Paula da [UNIFESP]
Orientadores
Tavassi, Ana Marisa Chudzinski [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Introdução: Estudos preliminares demonstraram que peptídeos desenhados a partir de
sequências de aminoácidos de proteínas purficadas a partir extrato bruto das cerdas da lagarta
L.obliqua e de proteínas recombinantes obtidas através de uma biblioteca de cDNA das
glândulas salivares do carrapato Amblyomma sculptun são capazes de desencadear
citoproteção. O processo autofágico mitocondrial pode ser considerado um mecanismo
citoprotetor e anti-inflamatório, pois além de favorecer a degradação das organelas
disfuncionais, induz alterações morfológicas que minimizam o escape de espécies reativas de
oxigênio (ROS) e de DNA mitocondrial (mtDNA) para o citoplasma. Os macrófagos
desempenham um papel central durante o processo inflamatório, portanto, eles foram
escolhidos como tipo celular para o estabelecimento de uma plataforma de screening usando
potencias peptídeos com funções biológicas. Objetivos: O presente trabalho tem como objetivo
geral avaliar a participação de peptídeos com atividade anti-inflamatória no processo de
autofagia de macrófagos derivados de THP-1, através da caracterização de novas vias que
levem a liberação de mtDNA e a ativação de vias inflamatórias. Métodos: O desenho e escolha
dos peptídeos mais promissores foi baseado em estudos prévios do grupo. Inicialmente, a
padronização do modelo celular para o screening foi definida através do perfil de translocação
do fator de transcrição NF-Kb utilizando a ferramenta de High-Content Screening (HCS), em
condições de privação de soro fetal bovino (1 % de SFB). Essa metodologia nos permitiu o
delineamento de forma semi-automatizada e customizada de todas as padronizações e
experimentos subsequentes, como por exemplo, avaliação da liberação de TNFα por multiplex;
caracterização da morfologia de redes mitocondriais através de microscopia confocal de
varredura utilizando sondas específicas; definição das condições de cultivo celular para a
liberação de mtDNA através de PCR em tempo real; e finalmente, o estudo da ativação da via
do inflamassoma NLRP3. Todos estes ensaios foram determinantes para a validação do modelo
celular. Resultados: Durante restrição calórica (1% SFB), observou-se redução significativa na
translocação de NF-kB, um parâmetro clássico para o estudo de autofagia. Por microscopia
confocal, verificou-se um aumento significativo das redes mitocondriais frente ao tratamento
com os peptídeos e sob restrição nutricional. Observou-se também uma redução da liberação
de mtDNA para o meio extracelular durante a privação de soro e sob o estímulo com os
peptídeos estudados. Ainda, verificamos uma redução da expressão da proteína NLRP3,
também durante a indução de autofagia e principalmente sob tratamento com o peptídeo
denominado L3. Conclusão: Diante dos resultados obtidos, pode-se sugerir que foi
implementado um modelo celular o screening de moléculas de interesse farmacológico que
permite estudar moléculas responsivas em condições inflamatórias e autofágicas.
Descrição
Citação
ROCHA, Ana Paula da. Estabelecimento de um modelo celular para o screening de peptídeos relacionados a liberação de DNA mitocondrial e a ativação de vias inflamatórias. 2021. 57 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas (Biologia Molecular) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2021.