Papel do receptor aril-hidrocarboneto na atividade imunomoduladora das células-tronco mesenquimais utilizando um modelo de lesão renal aguda

Abstract

Acute kidney injury (AKI) affects millions of people worldwide with elevated mortality rate. AKI is characterized by an acute tissue inflammation with influx of inflammatory cells. The aryl-hydrocarbon receptor (AhR) is a transcription factor present in several cells and in inflammatory infiltrating cells being involved mainly in the regulation of various biological processes including the immune response. In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) have a great immunotherapeutic potential, which can be regulated by specific receptors such as AhR. Thus, the precise mechanism associated to AhR activation in MSCs and its therapeutic role in AKI remains poorly elucidated. Therefore, in this study, we evaluated the activation of MSCs via AhR and functionally tested its therapy in an experimental model of cisplatin-induced AKI (15mg/kg, CEUA: 9656080916). Mouse adipose tissue-derived MSCs were expanded in cultures and activated with both kynurenine (KY, 50μM) or tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD, 0.2μM) agonists, which are natural and synthetic AhR inducers, respectively. At day 4 after cytotoxic injury, serum and renal tissues were collected to performing several analyzes (colorimetric, RT-PCR, flow cytometry, immunohistochemical and histopathological assays). First, we observed that MSCs were perfectly activated by AhR and expressed, in a dose-dependent manner, high levels of AhR responsive genes and its accessory molecules (CYP1b1, AhR and ARNT). In addition, these stimulated MSCs presented higher kinetics in culture (>Ki-67). Then, it was observed after both treatments with MSCs (unstimulated and KY-stimulated) similar protection in AKI-affected animals such as: lower weight loss, low creatinine and urea levels, preserved tubular renal architecture, reduced tissue apoptosis (caspase- 3) and diminished inflammation (IL-6, CCL2 and TNF-α). Moreover, we specifically analyzed in situ renal monocytes/macrophages (CD68 cells) and found lower cumulative frequency of these cells in mice treated with unstimulated MSCs. Renal macrophages (F4/80+/CD11b+) from group that received infusion of unstimulated MSCs also had an up-regulation of its immunoregulatory profile with decreased expression of M1 inflammatory markers (CCL2 and STAT3) and increased expression of M2 molecules (CD206, FIZZ1 and CX3CR1). Finally, we investigated the expression of genes associated with renal tissue metabolism and it was verified in kidneys of animals injected with unstimulated MSCs a reduced glycolytic profile (low HK2 and PK), whereas that kidneys of animals treated with KY-stimulated MSCs presented a β-oxidative pattern (high CPTA2 and ACOX1). In summary, we have documented that MSCs can be stimulated by KY via AhR and this licensing affected partially its immunoregulatory activities on renal macrophages in a model of cisplatin-induced AKI without impairing renoprotection. We believe that our findings could contribute with some insights concerning the mechanisms associated with MSCs activation and its application in several inflammatory diseases facilitating thus, its better therapeutic translation for clinical practice.

A lesão renal aguda (LRA) é uma doença que afeta milhões de pessoas ao redor do mundo possuindo uma alta mortalidade. A LRA possui como bases fisiopatológicas a inflamação a qual é caracterizada pelo influxo de células inflamatórias. O receptor aril-hidrocarboneto (AhR) é um fator de transcrição presente em várias células e em células inflamatórias infiltrantes, estando envolvido principalmente na regulação de diversos processos biológicos incluindo a resposta imune. Nesse contexto, as células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem um grande potencial imunoterapêutico, o qual pode ser regulado por receptores específicos como o AhR. Os efeitos precisos da ativação do AhR em MSCs, assim como o seu papel terapêutico em patologias específicas como a doença renal aguda ainda permanece pobremente elucidado. Portanto, neste presente trabalho, nós avaliamos a ativação do AhR nas MSCs e funcionalmente testamos sua terapêutica em um modelo experimental de lesão renal aguda induzido por cisplatina (15mg/kg, CEUA: 9656080916). As MSCs foram derivadas do tecido adiposo de camundongos, expandidas em culturas e ativadas com quenurenina (KY, 50μM) ou tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD, 0.2μM), indutores naturais e sintéticos do AhR, respectivamente. Ao final de 4 dias após indução da lesão citotóxica, soro e tecidos renais foram coletados para diversas analises (colorimétricas, RT-PCR, citometria de fluxo, imuno-histoquímicas e analises histopatológicas). Primeiro, observamos que as MSCs foram perfeitamente ativadas pelo AhR e expressaram, de maneira dose-dependente, altos níveis dos genes responsivos e moléculas acessórias a ativação do AhR (CYP1b1, AhR e ARNT), além de apresentarem uma elevada cinética em cultura (>Ki-67). Em seguida, foi detectado que ambos os tratamentos com MSCs (normais e estimuladas com KY), similarmente, protegeram os animais da LRA apresentando menor perda de peso, baixos índices de creatinina e ureia sérica, preservada arquitetura renal, apoptose reduzida (caspase-3) e baixa inflamação tecidual (IL-6, CCL2 e TNF-α). Adicionalmente, de forma específica, nós analisamos monócitos/macrófagos teciduais renais (células CD68) e verificamos menor frequência cumulativa em camundongos tratados com as MSCs normais. Os macrófagos renais (F4/80+CD11b+) do grupo que recebeu a infusão de MSCs normais também apresentaram um perfil mais imunoregulador com baixa expressão de marcadores inflamatórios M1 (CCL2 e STAT3) e aumento de marcadores anti-inflamatórios M2 (CD206, FIZZ1 e CX3CR1). Finalmente investigamos a expressão de genes associados ao metabolismo tecidual renal e foi constatado que os rins dos animais administrados com MSCs normais apresentaram um perfil menos glicolítico (baixo HK2 e PK), enquanto os rins de animais que receberam MSCs estimuladas com KY tiveram a via da β-oxidação hiper-regulada (elevado CPTA2 e ACOX1). Em suma, nós demostramos que as MSCs podem ser estimuladas por KY via AhR e que essa sensibilização afetou parcialmente as atividades imunoregulatórias das MSCs em macrófagos utilizando um modelo de LRA induzido por cisplatina, mas não afetou sua renoproteção. Esperamos que esses resultados possibilitem o melhor entendimento dos mecanismos associados a ativação das MSCs e sua aplicação em diversas patologias inflamatórias, facilitando assim, uma melhor translação terapêutica para a prática clínica.