Regulação Androgênica, Atividade Biológica e Sinalização Celular de Beta-Defensinas na Morfogênese do Epidídimo
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Data
2019-07-25
Autores
Ferreira, Lucas Garcia Alves [UNIFESP]
Orientadores
Winston, Maria Christina Werneck De Avellar [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Reproductive disorders in adult men, a topic of public health interest, may be related to develop-mental and masculinization abnormalities of the male reproductive tract. The mesonephric duct (or Wolffian duct) is an embryonic structure that undergoes a process of tubular-epithelial morphogenesis primarily induced by androgens that originates the epididymis, an essential organ for sperm maturation and function. Disruption of the development of this structure may result in infertility at adulthood, jus-tifying the need for a better understanding of the mechanisms and mediators driving epididymal mor-phogenesis. Our research group has recently identified the β-defensin SPAG11C (sperm associated an-tigen 11 C), a component of innate immunity, as an androgen-dependent mesenchymal factor that mod-ulates the rat mesonephric duct morphogenesis. We have also detected the expression of other β-defen-sins in this tissue. Members of this protein family can promote their effects via Toll-like receptor (TLR) cellular signaling. Taken together, the present aims of the study were to characterize the expression profile and the androgen regulation of a subset of β-defensins in the rat mesonephric duct, to investigate the functional aspects of the DEFB2 (defensin beta 2) and its potential involvement with TLR4 signaling pathway during the prenatal epididymal development, as well as to validate an experimental approach for the detection of recombinant β-defensin processing and secretion in a cell culture model. Our results revealed that the tested β-defensins presented differential gene expression, androgen regulation and cel-lular distribution profile during prenatal epididymal morphogenesis in rat. The β-defensin Defb4 tran-script, the homologue of human DEFB2 (hDEFB2), was negatively regulated between the embryonic days (e) 17.5 and 20.5, a period when the mesonephric duct morphological differentiation occurs. In ducts (e17.5) cultured ex vivo for 96 h, recombinant hDEFB2 reduced duct elongation and coiling as a result of increased cell death in both epithelial and mesenchymal cells. We have also observed that TLR4-induced signaling pathway is present and functional in the mesonephric duct, and its activation by LPS from E. coli can be negatively regulated by hDEFB2. Furthermore, we have validated a Western blot protocol for the detection of SPAG11C protein forms on cell lysate and supernatant from cultured human cells transiently transfected to express this β-defensin. Collectively, these results reveal the par-ticipation of innate immunity components on the scenario of mesonephric duct development, contrib-uting to increased knowledge of the functional repertoire and role of β-defensins in the epididymis and in events related to male fertility.
Disfunções reprodutivas em homens adultos, um tópico de interesse da saúde pública, podem estar relacionadas a anormalidades no desenvolvimento e na masculinização do trato reprodutor masculino. O ducto mesonéfrico (ou ducto de Wolff) é uma estrutura embrionária submetida a um programa de morfogênese túbulo-epitelial induzido primariamente por androgênios para originar o epidídimo, um órgão essencial para maturação e função espermática. Anormalidades no desenvolvimento dessa estru-tura podem resultar em infertilidade na vida adulta, o que justifica a melhor compreensão dos mecanis-mos e mediadores que regem a morfogênese epididimária. Recentemente, nosso grupo identificou a β-defensina SPAG11C (sperm associated antigen 11 C), um componente da imunidade inata, como um fator mesenquimal, dependente de androgênio e regulador da morfogênese do ducto mesonéfrico de rato. Detectamos também a expressão de outras β-defensinas nesse tecido. Membros dessa família de proteí-nas podem exercer seus efeitos via sinalização celular induzida por receptores do tipo Toll (TLRs). Dessa forma, os objetivos do presente trabalho foram caracterizar o perfil de expressão e regulação androgênica de um conjunto de β-defensinas no ducto mesonéfrico, investigar aspectos funcionais da DEFB2 (de-fensin beta 2) e sua possível relação com a sinalização via TLR4 durante o desenvolvimento pré-natal do epidídimo, bem como validar uma abordagem experimental para detecção do processamento e secre-ção de β-defensinas recombinantes em cultura celular. Os resultados revelaram que as β-defensinas tes-tadas apresentaram perfis diferenciais de expressão gênica, regulação androgênica e distribuição celular durante o desenvolvimento pré-natal do epidídimo de rato. A β-defensina Defb4, homóloga da DEFB2 humana (hDEFB2), mostrou-se regulada negativamente entre os dias embrionários (e) 17,5 e 20,5, pe-ríodo em que ocorre a diferenciação morfológica do ducto mesonéfrico. Em ductos e17,5 que foram cultivados ex vivo por 96 h, a hDEFB2 recombinante reduziu o crescimento e o enovelamento do tecido ao aumentar a apoptose no epitélio e no mesênquima. Observamos também que a via de sinalização do TLR4 é funcional no ducto mesonéfrico e que sua ativação por LPS de E. coli é regulada negativamente pela hDEFB2. Além disso, validamos a metodologia de Western blot para detecção de produtos do pro-cessamento da SPAG11C em extrato celular e sobrenadante de culturas de células humanas transfectadas de forma transiente para essa β-defensina. Esses resultados apontam para a participação de componentes da imunidade inata no cenário de desenvolvimento do ducto mesonéfrico e ampliam o repertório funci-onal das β-defensinas no epidídimo e em eventos relacionados à fertilidade masculina.
Disfunções reprodutivas em homens adultos, um tópico de interesse da saúde pública, podem estar relacionadas a anormalidades no desenvolvimento e na masculinização do trato reprodutor masculino. O ducto mesonéfrico (ou ducto de Wolff) é uma estrutura embrionária submetida a um programa de morfogênese túbulo-epitelial induzido primariamente por androgênios para originar o epidídimo, um órgão essencial para maturação e função espermática. Anormalidades no desenvolvimento dessa estru-tura podem resultar em infertilidade na vida adulta, o que justifica a melhor compreensão dos mecanis-mos e mediadores que regem a morfogênese epididimária. Recentemente, nosso grupo identificou a β-defensina SPAG11C (sperm associated antigen 11 C), um componente da imunidade inata, como um fator mesenquimal, dependente de androgênio e regulador da morfogênese do ducto mesonéfrico de rato. Detectamos também a expressão de outras β-defensinas nesse tecido. Membros dessa família de proteí-nas podem exercer seus efeitos via sinalização celular induzida por receptores do tipo Toll (TLRs). Dessa forma, os objetivos do presente trabalho foram caracterizar o perfil de expressão e regulação androgênica de um conjunto de β-defensinas no ducto mesonéfrico, investigar aspectos funcionais da DEFB2 (de-fensin beta 2) e sua possível relação com a sinalização via TLR4 durante o desenvolvimento pré-natal do epidídimo, bem como validar uma abordagem experimental para detecção do processamento e secre-ção de β-defensinas recombinantes em cultura celular. Os resultados revelaram que as β-defensinas tes-tadas apresentaram perfis diferenciais de expressão gênica, regulação androgênica e distribuição celular durante o desenvolvimento pré-natal do epidídimo de rato. A β-defensina Defb4, homóloga da DEFB2 humana (hDEFB2), mostrou-se regulada negativamente entre os dias embrionários (e) 17,5 e 20,5, pe-ríodo em que ocorre a diferenciação morfológica do ducto mesonéfrico. Em ductos e17,5 que foram cultivados ex vivo por 96 h, a hDEFB2 recombinante reduziu o crescimento e o enovelamento do tecido ao aumentar a apoptose no epitélio e no mesênquima. Observamos também que a via de sinalização do TLR4 é funcional no ducto mesonéfrico e que sua ativação por LPS de E. coli é regulada negativamente pela hDEFB2. Além disso, validamos a metodologia de Western blot para detecção de produtos do pro-cessamento da SPAG11C em extrato celular e sobrenadante de culturas de células humanas transfectadas de forma transiente para essa β-defensina. Esses resultados apontam para a participação de componentes da imunidade inata no cenário de desenvolvimento do ducto mesonéfrico e ampliam o repertório funci-onal das β-defensinas no epidídimo e em eventos relacionados à fertilidade masculina.