Sequenciamento de proteoformas de inibidores de protease do quiabo e avaliação de citotoxicidade em células de Leucemia Mieloide Crônica

Abstract

Objective: To perform the sequencing of new proteoforms of Kunitz-type protease inhibitors with lectin-like domain extracted from okra (Abelmoschus esculentus L. Moench) seeds, besides evaluating the cytotoxicity of these proteins against chronic myeloid leukemia (CML) K562 and Lucena cell lines. Methods: Proteoforms were sequenced by an integrative analysis with liquid chromatography coupled to mass spectrometry in-tandem (LC-MS/MS), de novo peptide sequencing, manual assembly of coding sequences from the transcripts (CDS), proteogenomic analysis and assessment of intact mass by LC-MS analysis. The cytotoxic effect of the inhibitors was evaluated by measuring mitochondrial dehydrogenase activity (MTT assay). Results: From the peptides produced by 6 proteolytic enzymes, the overlap of 193 peptides was obtained by de novo sequencing analysis, resulting in a primary structure of 193 amino acids. However, given the complexity resulting from a mixture of peptides belonging to more than one proteoform, the complete sequencing could not be done only by de novo sequencing analysis. Thus, the peptide sequences of this previously assembled structure were submitted to alignment against the raw okra transcriptome data to build the nucleotide sequences encoding the proteoforms and by an iterative process, the protein sequences of 7 proteoforms were assembled, as well as their respective CDSs. Then, the MS/MS spectra of the de novo peptides were submitted to search against a personalizated database containing the 7 proteoforms sequences, resulting in coverage of 91-95%. The intact mass analysis indicated 11 average masses of 20.4-20.9 kDa, of which 7 corresponded to the mature proteoforms previously reported by the CDS assembly; 2 belonging to the mutated forms of AelKI-1 (M162V) and AelKI-4 (E146K); and 2 belonging to truncated forms of AelKI-3. In this analysis, the differences between experimentally calculated and theoretical masses were equivalent to 3 disulfide bonds, as well as in the prediction of the resulting tertiary structure. The AelKI proteoforms were able to reduce cell viability of Lucena (IC50 = 17.4 ±4 μg/mL) and K562 (IC50 = 30.7 ±9 μg/mL) cell lines and had low cytotoxicity on the fibroblast cell line (control) in which the IC50 was undetermined at the highest dosage (100 μg/mL). Conclusion: The sequencing of AelKI proteoforms shows the utility of using these methods in a complementary way to reveal the primary structures and their characteristics, especially when the genome is lacking. In addition, the antitumor activities make the AelKI proteoforms promising antileukemic agent candidates.

Objetivos: Realizar o sequenciamento de novas proteoformas de inibidores de protease do tipo Kunitz com domínio lectínico extraídos de sementes do quiabo (Abelmoschus esculentus L. Moench), além de avaliar as citotoxicidades dessas proteínas contra linhagens celulares K562 e Lucena de leucemia mieloide crônica (LMC). Métodos: As proteoformas foram sequenciadas por uma combinação das técnicas de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas in tandem (LC-MS/MS), sequenciamento de novo de peptídeos, montagem manual da sequência codificante do transcrito (CDS), análise proteogenômica e avaliação das massas intactas por LC-MS. O efeito citotóxico dos inibidores foi avaliado pela mensuração da atividade de desidrogenase mitocondrial (ensaio MTT). Resultados: A partir dos peptídeos produzidos por 6 enzimas proteolíticas, foi realizada a sobreposição de 193 peptídeos obtidos por análise de novo, resultando em estrutura primária de 193 aminoácidos. Porém, dada a complexidade resultante de uma mistura de peptídeos pertencentes a mais de uma proteoforma, o completo sequenciamento não pôde ser efetuado apenas pela análise de novo. Assim, sequências peptídicas desta estrutura previamente montada foram submetidas a alinhamentos contra dados brutos de transcriptoma do quiabo para realizar a montagem das sequências nucleotídicas que as codificam e, através de um processo iterativo, as sequências proteícas de 7 proteoformas foram montadas, bem como seus respectivos CDSs. Em seguida, os espectros de MS/MS dos peptídeos de novo foram então analisados por busca em um banco de dados personalizado contendo as 7 proteoformas, resultando em uma convergência de 91-95%. As análises de massa intacta indicaram 11 massas médias entre 20,4-20,9 kDa, das quais 7 corresponderam às formas maduras das proteoformas previamente reportadas; 2 pertencentes às formas mutadas da AelKI-1 (M162V) e AelKI-4 (E146K); e 2 à formas truncadas de AelKI-3. Nesta análise, foi observada a formação de 3 ligações dissulfeto para cada proteoforma, assim como no resultado da predição da estrutura terciária. As proteoformas da AelKI foram capazes de reduzir a viabilidade celular das linhagens tumorais Lucena (IC50 = 17,4 ±4 μg/mL) e K562 (IC50 = 30,7 ±9 μg/mL) e apresentaram baixa citotoxicidade sobre a linhagem de fibroblasto (controle) com IC50 indeterminado na maior dosagem (100 μg/mL). Conclusão: O sequenciamento das proteoformas AelKI evidencia a utilidade do uso destes métodos de forma complementar para revelar a estrutura primária e características estruturais, principalmente, quando o genoma é desconhecido. Além disso, as atividades antitumorais destas proteoformas as tornam promissoras candidatas a agentes antileucêmicos.