Determinação da estrutura tridimensional por difração de raios-X da Brazilian Klebisiella Carbapenemase- BKC-1
Data
2019-07-25
Autores
Silva, Paola Jacque De Souza Nascimento Da 
Orientadores
Oliveira, Vitor Marcelo Silveira Bueno Brandao De
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Background: The emergence and spread of antimicrobial resistance is one of the biggest threats to global health, particularly among the pathogens of medical significance, as the Gram-negative bacilli and members of the family Enterobacteriaceae, also species Klebsiella pneumoniae. The mechanism of resistance of these pathogens is the production of β-lactamases. These enzymes degrade antimicrobial containing a β-lactam ring. Even though well described the process by which the extended spectrum β-lactamase promote catalysis of antimicrobials β-lactam antibiotics, the mode by which the carbapenemases degrade the carbapenems are not yet fully established. Methods: The aim of this study was to study the structure and the mechanisms of action of a new class A carbapenemase of the Ambler classification scheme, BKC-1, identified in clinical specimes of Klebsiella pneumoniae resistant to carbapenems, isolated from two hospitals located in São Paulo, Brazil. In order to achieve the goal proposed we use recombinant enzyme and the gene blaBKC-1 was cloned and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) derived strains grown to 20° for 16 hours. The conditions of extraction and purification of the recombinant enzyme have been optimized. Different osmotic shock protocols for protein extraction of periplasmic space were realized, the protein fraction of the periplasmic content was treated with ammonium sulphate solution, 85% saturated, to remove some contaminants and allow the reduction of volume of material. Purification of the recombinant protein was performed by the hydrophobic interaction chromatography, ion-exchange and molecular exclusion. The purified protein was stored in 10 mm Tris pH 8.0 to -20°C. For the tests of crystallization was adopted the sitting drop vapor diffusion technique, single crystals were obtained of the BKC, which were submitted to x-ray diffraction. The mutagenesis by PCR-driven overlap extension was used to evaluate the participation of the most conserved amino acid residues in the catalytic activity and mechanism of action of the enzyme. Were produced and sequenced six mutants. The mutant pET-BKC-1-S92A was expressed following the same protocol for protein extraction and purification for the BKC-WT. Was performed several co-cristalização tests for this mutant complexed with different ligands. The best crystals were selected and diffracted x-ray on Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, in Campinas-SP. Results: 3D structure of BKC-1 showed similarity to other β- xxi lactamases of the class A, consisting of two domains. The absence of the Cys238 residue and the insertion of the amino acid residue Tyr in the handle (Ω loop) suggest that a greater degree of flexibility of this protein conformational changes occur allows that can explain the carbapenemase activity. The data sets obtained from recombinant protein cocristalização with mutation in the residue Ser92Ala complexed with benzylpenicillin presented low densities, while for the other complexes, were not observed electronic densities which were characteristics of these substances.
A emergência e disseminação da resistência aos antimicrobianos são problemas de grande importância mundial, particularmente entre os patógenos de importância clínica, como os bacilos Gram negativos e membros da família Enterobacteriaceae, em especial a espécie Klebsiella pneumoniae. O principal mecanismo de resistência desses patógenos é a produção de β-lactamases, que são enzimas que degradam antimicrobianos contendo um anel β-lactâmico. Apesar de bem descrito o processo pela qual as β-lactamases de espectro estendido promovem a catálise dos antimicrobianos β-lactâmicos, o modo pela qual as carbapenemases degradam os carbapenens ainda não está completamente estabelecido. O principal objetivo do presente trabalho foi estudar a estrutura e os mecanismos de ação de uma nova carbapenemase da classe A de Ambler, a BKC-1, identificada em amostras clínicas de Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenens, isoladas de dois hospitais da cidade de São Paulo. Métodos: Para se atingir o objetivo proposto utilizamos a enzima recombinante, o gene blaBKC-1 foi clonado e expresso em células de Escherichia coli BL21 (DE3) cultivadas a 20°C por 16 horas. As condições de extração e purificação da enzima recombinante foram otimizadas. Diferentes protocolos de choque osmótico para a extração da proteína do espaço periplasmático foram realizados, a fração proteica do conteúdo periplasmático foi tratada com solução de sulfato de amônio, 85% saturada, de forma remover alguns contaminantes e permitir a redução de volume do material a ser posteriormente tradado. A proteína recombinante pET-BKC1 foi purificada por cromatografia de interação hidrofóbica, troca iônica e exclusão molecular. A proteína purificada foi estocada em solução de 10mM Tris pH 8,0 à - 20ºC. Para os ensaios de cristalização empregou- se a técnica de difusão de vapor por sitting drop e após diversas tentativas, foram obtidos cristais únicos da BKC nativa, os quais foram submetidos à difração de raios-X. A mutagênese por PCR de extensão por sobreposição foi utilizada para avaliar a participação dos resíduos de aminoácidos mais conservados na atividade catalítica e no mecanismo de ação da enzima. Foram produzidos e sequenciados seis mutantes. O mutante pET-BKC-1-S92A foi expresso seguindo o mesmo protocolo de extração e purificação empregados para a BKC-WT. Foi efetuado diversos ensaios de co-cristalização para este mutante complexado com diferentes ligantes. Os melhores cristais foram selecionados e difratados por raios X xix no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, em Campinas-SP. Resultados: A estrutura 3D da BKC-1 apresentou similaridade às outras β-lactamases de classe A, sendo constituída por dois domínios. A ausência do resíduo Cys238 e a inserção do resíduo de aminoácido Tyr na região da alça (Ω loop) sugerem que um grau maior de flexibilidade desta proteína permite que ocorram mudanças conformacionais que podem explicar a atividade carbapenemase. Os conjuntos de dados obtidos a partir de cocristalização da proteína recombinante com a mutação no resíduo Ser92Ala complexada com benzilpenicilina apresentaram baixas densidades eletrônicas, enquanto que para os demais complexos, não foram observadas densidades eletrônicas que fossem características dessas substâncias.
A emergência e disseminação da resistência aos antimicrobianos são problemas de grande importância mundial, particularmente entre os patógenos de importância clínica, como os bacilos Gram negativos e membros da família Enterobacteriaceae, em especial a espécie Klebsiella pneumoniae. O principal mecanismo de resistência desses patógenos é a produção de β-lactamases, que são enzimas que degradam antimicrobianos contendo um anel β-lactâmico. Apesar de bem descrito o processo pela qual as β-lactamases de espectro estendido promovem a catálise dos antimicrobianos β-lactâmicos, o modo pela qual as carbapenemases degradam os carbapenens ainda não está completamente estabelecido. O principal objetivo do presente trabalho foi estudar a estrutura e os mecanismos de ação de uma nova carbapenemase da classe A de Ambler, a BKC-1, identificada em amostras clínicas de Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenens, isoladas de dois hospitais da cidade de São Paulo. Métodos: Para se atingir o objetivo proposto utilizamos a enzima recombinante, o gene blaBKC-1 foi clonado e expresso em células de Escherichia coli BL21 (DE3) cultivadas a 20°C por 16 horas. As condições de extração e purificação da enzima recombinante foram otimizadas. Diferentes protocolos de choque osmótico para a extração da proteína do espaço periplasmático foram realizados, a fração proteica do conteúdo periplasmático foi tratada com solução de sulfato de amônio, 85% saturada, de forma remover alguns contaminantes e permitir a redução de volume do material a ser posteriormente tradado. A proteína recombinante pET-BKC1 foi purificada por cromatografia de interação hidrofóbica, troca iônica e exclusão molecular. A proteína purificada foi estocada em solução de 10mM Tris pH 8,0 à - 20ºC. Para os ensaios de cristalização empregou- se a técnica de difusão de vapor por sitting drop e após diversas tentativas, foram obtidos cristais únicos da BKC nativa, os quais foram submetidos à difração de raios-X. A mutagênese por PCR de extensão por sobreposição foi utilizada para avaliar a participação dos resíduos de aminoácidos mais conservados na atividade catalítica e no mecanismo de ação da enzima. Foram produzidos e sequenciados seis mutantes. O mutante pET-BKC-1-S92A foi expresso seguindo o mesmo protocolo de extração e purificação empregados para a BKC-WT. Foi efetuado diversos ensaios de co-cristalização para este mutante complexado com diferentes ligantes. Os melhores cristais foram selecionados e difratados por raios X xix no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, em Campinas-SP. Resultados: A estrutura 3D da BKC-1 apresentou similaridade às outras β-lactamases de classe A, sendo constituída por dois domínios. A ausência do resíduo Cys238 e a inserção do resíduo de aminoácido Tyr na região da alça (Ω loop) sugerem que um grau maior de flexibilidade desta proteína permite que ocorram mudanças conformacionais que podem explicar a atividade carbapenemase. Os conjuntos de dados obtidos a partir de cocristalização da proteína recombinante com a mutação no resíduo Ser92Ala complexada com benzilpenicilina apresentaram baixas densidades eletrônicas, enquanto que para os demais complexos, não foram observadas densidades eletrônicas que fossem características dessas substâncias.
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Citação
SILVA, Paola Jacque de Souza Nascimento da. Determinação da Estrutura tridimensional por difração de raios-X da Brazilian Klebisiella Carbapenemase- BKC-1. 2019. 99f. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular ) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2019.