Vesículas extracelulares derivadas de células estromais mesenquimais modulam células do sistema imune, induzindo um perfil regulador

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Data
2019-01-29
Autores
Cunha, Flavia Franco Da [UNIFESP]
Orientadores
Camara, Niels Olsen Saraiva [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Introduction: Mesenchymal stromal cells (MSCs) can generate immunological tolerance due to their modulatory activity in T and B cells, dendritic cells (DCs) and natural killer cells. Extracellular vesicles (EVs) are one of the main mechanisms by which MSCs exert their actions. Objectives: In this study, our objective was to evaluate whether MSCs-EVs can, by themselves, modulate the immune response, generating a regulatory profile. Methods: MSCs were expanded and EVs were obtained by ultracentrifugation of the supernatant. Bone marrow-DCs were expanded with GM-CSF. The incorporation of MSCEVs by DCs and T cells was detected by confocal microscopy. Expression of surface markers was detected by flow cytometry (FACS) and cytokines were detected by RTPCR, ELISA, FACS and confocal microscopy. A miRNA PCR array was performed to evaluate the expression profile of miRNAs. Results: We demonstrated that MSC-EVs were incorporated by DCs and lymphocytes in vitro. Treatment with MSC-EVs did not affect the expression of surface markers on DCs, but affected their function, mainly by the increase of IL-10 protein. In addition, TCD4+ cells in the presence of DCs pretreated with MSC-EVs demonstrated less differentiation for a Th1 profile (IFNγ+) when compared to untreated DCs. When the effect of MSC-EVs was evaluated directly on T cells, addition of EVs induced less proliferation and less Th1 differentiation. Interestingly, in a specific Th1 polarization, the addition of MSC-EVs increased Foxp3 expression, also generating subpopulations of IFNγ+/Foxp3+ T cells. Previous treatment with RNAse appeared to partially abolish some of the functions, suggesting an important role of RNAs/miRNAs in this regulation. Finally, we observed a differential expression profile of miRNAs in Th1 cells treated with MSC-EVs, as well as modulation of one of their target genes, TGFbR2. The treatment with EVs also altered the mitochondrial metabolism of Th1-differentiated T cells, suggesting the involvement of the TGFβ pathway in this metabolic modulation. Conclusions: Our data suggest that MSCs-EVs are able to modulate the immune response, generating a regulatory profile, especially in activated T cells.
Introdução: As células estromais mesenquimais (MSCs) podem gerar tolerância imunológica devido à sua atividade moduladora em células T e B, células dendríticas (DCs) e células natural killer. As vesículas extracelulares (EVs) são um dos principais mecanismos pelos quais as MSCs exercem suas ações. Objetivos: Neste estudo, nosso objetivo foi avaliar se as EVs derivadas de MSCs (MSC-EVs) podem, por si só, modular a resposta imune, gerando um perfil regulador. Métodos: MSCs foram expandidas e as EVs foram obtidas por ultracentrifugação do sobrenadante. DCs da medula óssea foram expandidas com GM-CSF. A incorporação de MSC-EVs por DCs e células T foi detectada por microscopia confocal. As DCs tratadas com MSC-EVs foram usadas como estímulo para ativação e diferenciação de células T. A expressão dos marcadores de superfície foi detectada por citometria de fluxo (FACS) e as citocinas foram detectadas por RT-PCR, ELISA, FACS e microscopia confocal. Um PCR array de miRNA foi realizado para avaliar o perfil de expressão de miRNAs. Resultados: Nós demonstramos que as MSC-EVs foram incorporadas pelas DCs e linfócitos in vitro. O tratamento com MSC-EVs não afetou a expressão dos marcadores de superfície nas DCs, mas afetou a função das mesmas, principalmente pelo aumento da proteína IL-10. Adicionalmente, as células TCD4+ na presença de DCs pré-tratadas com MSC-EVs demonstraram menor diferenciação para um perfil Th1 (IFNγ+) quando comparadas com DCs não tratadas. Quando o efeito das MSC-EVs foi avaliado diretamente nas células T, a adição de EVs induziu uma menor proliferação e menor diferenciação para um perfil Th1. Interessantemente, em uma condição específica de polarização para Th1, a adição de MSC-EVs aumentou a expressão de Foxp3, gerando também subpopulações de células T IFNγ+/Foxp3+. O tratamento prévio das EVs com RNAse pareceu abolir parcialmente algumas das funções, sugerindo um importante papel dos RNAs/miRNAs nesta regulação. Por fim, observamos um perfil diferencial de expressão de miRNAs em células Th1 tratadas com MSC-EVs, assim como modulação de um de seus genes alvos, o TGFbR2. O tratamento com MSC-EVs alterou ainda o metabolismo mitocondrial das células T diferenciadas para Th1, sugerindo o envolvimento da via do TGFβ nessa modulação metabólica.
Descrição
Citação
CUNHA, Flavia Franco da. Vesiculas extracelulares derivadas de celulas estromais mesenquimais modulam celulas do sistema imune, induzindo um perfil regulador. 2019. 74f. Tese (Doutorado em Nefrologia) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2019.