Estrutura de carreadores de ácidos nucleicos baseados no peptídeo troiano penetratina
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Data
2019-04-25
Autores
Mello, Lucas Rodrigues De [UNIFESP]
Orientadores
Silva, Emerson Rodrigo Da [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Elucidate the spatial organization of the Trojan peptide Penetratin, and a new heptamer with sequence KIWFQNR, conjugated with DNA at nanoscopic scale. To investigate the viability of the KIWFQNR sequence as a carrier for DNA in gene therapy-related applications. Methods: Structural organization, aggregation and cell imaging were determined by small angle X-ray scattering (SAXS), confocal microscopy, transmission electron microscopy (TEM), Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), atomic force microscopy (AFM), infrared atomic force microscopy (AFM-IR), fluorimetry and circular dichroism (CD). Transfection assays were performed in different cell lines using the EGFP gene as a reporter. Conclusions: A model for the conjugation between Penetratin and DNA is proposed, where complexes aggregate into highly-condensed micrometric structures with “beads-on-a-string” morphology. The inner structure is ordered and nanospectroscopy data indicate that DNA is concentrated at the interfaces between complexes and surrounding medium. Complexes based on the KIWFQNR peptide self-assemble into thinner fibrillar structures, without the formation of condensates. The organization of both peptides follows a random-to-β-sheet transition at secondary structure, which is a key step for structuration according the proposed models. Cell assays show that complexes formed by the heptamer are able to interact with biological membranes.
Estudar a organização espacial do peptídeo troiano Penetratina, e de um heptâmero com sequência KIWFQNR, conjugados com DNA em escala nanoscópica. Investigar a viabilidade da sequência KIWFQNR como um carreador de DNA em aplicações relacionadas à terapia gênica. Métodos: Organização estrutural, agregação e imageamento de células foram determinadas por espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), microscopia confocal, microscopia eletrônica de transmissão (TEM), espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), microscopia de força atômica (AFM), microscopia de força atômica infravermelha (AFM-IR), fluorimetria e dicroísmo circular (CD). Ensaios de transfecção foram realizados em diferentes linhagens celulares usando o gene EGFP como repórter. Conclusões: Um modelo para a conjugação entre Penetratina e DNA foi proposto, onde os complexos se agregam em estruturas micrométricas altamente condensadas com a forma de “colar de contas”. A estrutura interna é ordenada e dados de nanoespectroscopia indicam que o DNA se concentra nas interfaces do complexo com o meio ao redor. Complexos baseados no peptídeo KIWFQNR se organizam em estruturas fibrilares finas, sem a formação de condensados. A estruturação dos dois peptídeos obedece a uma transição de conformações desordenadas para arranjos tipo β-folha em sua estrutura secundária, o que é um passo fundamental para a estruturação de acordo com os modelos propostos. Ensaios celulares mostram que complexos formados pelo heptapeptídeo são capazes de interagir com membranas biológicas
Estudar a organização espacial do peptídeo troiano Penetratina, e de um heptâmero com sequência KIWFQNR, conjugados com DNA em escala nanoscópica. Investigar a viabilidade da sequência KIWFQNR como um carreador de DNA em aplicações relacionadas à terapia gênica. Métodos: Organização estrutural, agregação e imageamento de células foram determinadas por espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), microscopia confocal, microscopia eletrônica de transmissão (TEM), espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), microscopia de força atômica (AFM), microscopia de força atômica infravermelha (AFM-IR), fluorimetria e dicroísmo circular (CD). Ensaios de transfecção foram realizados em diferentes linhagens celulares usando o gene EGFP como repórter. Conclusões: Um modelo para a conjugação entre Penetratina e DNA foi proposto, onde os complexos se agregam em estruturas micrométricas altamente condensadas com a forma de “colar de contas”. A estrutura interna é ordenada e dados de nanoespectroscopia indicam que o DNA se concentra nas interfaces do complexo com o meio ao redor. Complexos baseados no peptídeo KIWFQNR se organizam em estruturas fibrilares finas, sem a formação de condensados. A estruturação dos dois peptídeos obedece a uma transição de conformações desordenadas para arranjos tipo β-folha em sua estrutura secundária, o que é um passo fundamental para a estruturação de acordo com os modelos propostos. Ensaios celulares mostram que complexos formados pelo heptapeptídeo são capazes de interagir com membranas biológicas
Descrição
Citação
MELLO, Lucas Rodrigues de. Estrutura de carreadores de ácidos nucleicos baseados no peptídeo troiano penetratina. 2019. 84f. Dissertação ( Mestrado em Biologia Molecular) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2019.