Influência da composição da membrana fosfolipídica sobre a seletividade e citotoxicidade de peptídeos bioativos com ação antimicrobiana e antitumoral

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Data
2019-10-31
Autores
Silva, Laiz Da Costa [UNIFESP]
Orientadores
Miranda Filho, Manoel De Arcisio [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Bioactive peptides are a class of biomolecules with broad biological activity. Initially, these peptides attracted attention because of their proven antimicrobial action. In recent years, however, many peptides of this class have come to be studied as potential antitumor drugs. Cholesterol, the main component of mammalian lipid membranes, is regarded as the main reducer of the activity of these peptides in eukaryotic cells. The presence of phosphatidylserine (PS) in the outer monolayer of the lipid membrane of tumor cells is indicated as a potentiator of the action of these peptides in them. In this project we aimed to study the influence of these two lipids on the action of bioactive peptides with antimicrobial and antitumor action. Using biomimetic models we showed that the increase in the cholesterol content of the preparations decreased the number of pores formed by the peptides as well as reduced the time in which they remained open, reflecting the content of the fluorescent marker released by them. This change is not, however, due to structural changes suffered by peptides. The removal of cholesterol from the cell membranes decreased the viability of the strains exposed to different concentrations of the peptides; as well as increased the internalization of Propidium Iodide (PI), evidencing the greater capacity of these peptides to form pores in them. The incorporation of cholesterol in the membrane of bacteria increased their resistance to the action of the peptide. In the colocalization experiments, we observed accumulation of peptides in regions of accumulation of cholesterol. These results led us to propose a model for the action of cholesterol in eukaryotic cells. Cell viability experiments showed two peptides from a newly synthesized family as the most promising in this class, showing a significant reduction in viable cell contents even after short incubation intervals (30 minutes). Flow cytometry experiments, PI internalization and nuclear labeling showed that in short incubation intervals peptides kill cells by necrosis, but after long incubation intervals apoptotic cells are also observed. Experiments with large unilamellar vesicles showed an action dependent on PS content. Together, these results confirm the influence of this lipid on the activity of bioactive peptides with antitumor action.
Peptídeos bioativos constituem uma classe de biomoléculas com ampla atividade biológica. Inicialmente, estes peptídeos atraíram atenção devido a sua comprovada ação antimicrobiana. Nos últimos anos, no entanto, muitos peptídeos dessa classe passaram a ser estudados como potenciais fármacos antitumorais. O colesterol, principal componente das membranas lipídicas de mamíferos, é apontado como o principal redutor da atividade destes peptídeos em células eucarióticas. Já a presença de fosfatidilserina (PS) na monocamada externa da membrana lipídica de células tumorais é apontada como um potencializador da ação destes peptídeos nas mesmas. Neste projeto tivemos como alvo o estudo da influência destes dois lipídeos na ação de peptídeos bioativos com ação antimicrobiana e antitumoral. Utilizando modelos biomiméticos mostramos que o aumento do teor de colesterol das preparações diminuiu o número de poros formados pelos peptídeos assim como reduziu o tempo em que os mesmos permaneciam abertos, refletindo no teor de marcador fluorescente liberado pela ação destes. Esta alteração não se deve, no entanto, a alterações estruturais sofridas pelos peptídeos. A retirada de colesterol das membranas celulares diminuiu a viabilidade das linhagens expostas a diferentes concentrações dos peptídeos; bem como aumentou a internalização de Iodeto de Propídio (IP), evidenciando a maior capacidade de estes peptídeos formarem poros nas mesmas. Já a incorporação de colesterol na membrana de bactérias aumentou a resistência das mesmas à ação do peptídeo. Nos experimentos de co-localização, observamos acúmulo de peptídeos em regiões de acúmulo de colesterol e nos experimentos de ligação observamos uma interação entre os peptídeos e este esterol. Estes resultados nos levaram a propor um modelo para a ação do colesterol em células eucarióticas. Experimentos de viabilidade celular apontaram dois peptídeos de uma família recém-sintetizada como os mais promissores desta classe, mostrando uma redução significativa do teor de células viáveis mesmo depois de curtos intervalos de incubação (30 minutos). Experimentos de citometria de fluxo, internalização de IP e marcação nuclear mostraram que em curtos intervalos de incubação os peptídeos matam as células por necrose, mas que após longos intervalos de incubação observam-se também células apoptóticas. Experimentos com vesículas unilamelares grandes mostraram uma estruturação e ação dependentes do teor de PS. Em conjunto, estes resultados confirmam a influência deste lipídeo na atividade de peptídeos bioativos com ação antitumoral.
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