Estudo da imobilização da enzima fenilalanina desidrogenase em filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett de ácido esteárico e sua possível aplicação na detecção do aminoácido fenilalanina

Abstract

O presente trabalho descreve o estudo da atividade superficial da enzima fenilalanina desidrogenase (PDH), pura e na presença do surfactante ácido esteárico (HSt), como filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett (LB). Para isso, empregamos técnicas de análise físico-química que permitiram avaliar a formação, morfologia, estruturação molecular, e estabilidade termodinâmica dos filmes produzidos. Estudos iniciais da atividade de superfície da PDH em água indicaram a presença de processos de adsorção/dessorção dinâmicos característicos de monocamadas interfaciais de materiais solúveis (monocamadas de Gibbs). O aumento da força iônica na subfase aquosa possibilitou a adsorção da enzima na interface, produzindo monocamadas de Langmuir estáveis. Os filmes formados na interface líquida foram transferidos para suportes sólido usando a técnica de LB com razões de transferência próximas à unidade em pressões de superfície de 30 mN/m. Espectroscopias na região do Infravermelho e por dicroísmo circular (DC) indicaram a presença majoritária de estruturas em α-hélice paralelamente orientadas ao plano da superfície do suporte sólido. O filme de PDH apresentou alta rugosidade relativa e espessura média de 8 nm, conforme revelado por microscopia de força atômica (AFM). A enzima se inseriu regularmente em monocamadas do surfactante HSt, produzindo filmes de Langmuir mistos, interagindo com sinergia positiva, elevada pressão de exclusão de 25,3 mN/m e estabilidade termodinâmica suficiente para permitir a posterior transferência a suportes sólidos. Os filmes mistos PDH-HSt foram transferidos com sucesso para suportes sólidos de quartzo com taxas de transferência próximas à unidade, formando filmes LB com arquitetura do tipo Y com um máximo de 15 camadas. O crescimento do filme foi acompanhado através de técnicas espectroscópicas (fluorescência e DC) e de microscopia (AFM), apresentando sinais de intensidade diretamente de fluorescência proporcionais ao número de monocamadas transferidas. Observou-se também que interações hidrofóbicas entre a enzima e os grupos apolares do ácido carboxílico produziram alterações conformacionais na estrutura secundária da PDH, evidenciado pelo surgimento de bandas espectrais (infravermelho e DC) do tipo β-folha. A capacidade do filme em detectar o aminoácido L-fenilalanina a uma concentração fixa de 2,5 mM foi testada em tampão glicina (pH 10,4) por meio da técnica de espectroscopia no UV-vis, apresentando uma atividade de 7,2x10-4 min-1 para o filme LB com 15 camadas. Assim, foi possível verificar, como prova de conceito, que a produção de filmes de Langmuir estáveis da enzima PDH na presença de ácido esteárico podem ser utilizados na construção de filmes Langmuir-Blodgett capazes de detectar o aminoácido L-fenilalanina.

The present work describes the study of the surface activity of the enzyme phenylalanine dehydrogenase (PDH), pure and in the presence of the stearic acid surfactant (HSt), such as Langmuir and Langmuir-Blodgett (LB) films. For this, we employed physical-chemical techniques that allowed evaluating the formation, morphology, molecular structure, and thermodynamic stability of the films produced. Initial studies of the surface activity of PDH in water indicated the presence of dynamic adsorption/desorption processes, characteristic of interfacial monolayers of soluble materials (Gibbs monolayers). The increase of the ionic strength in the aqueous subphase enabled the adsorption of the enzyme at the interface, Langmuir monolayers sufficiently stable to be transferred to solid supports. The films formed at the liquid interface were transferred to solid supports using the LB technique, with transfer ratios close to the unit at surface pressures as high as 30 mN/m. Infrare and circular dichroism (DC) spectroscopies indicated the majority of α-helix structures parallel to the plane of the solid support surface. The PDH film showed high relative roughness and an average thickness of 8 nm, as revealed by atomic force microscopy (AFM) measurements. The enzyme was inserted regularly in monolayers of the fatty acid HSt, producing mixed Langmuir films, interacting with positive synergy, high exclusion pressure of 25.3 mN/m and thermodynamic stability. Mixed PDH-HSt films were successfully transferred to solid quartz supports with transfer ratios close to the unit forming Y-type LB films, with structures up to 15 layers. The growth of the film was followed by spectroscopic (fluorescence and DC) and microscopy techniques (AFM), showing intensity signals of fluorescence directly proportional to the number of transferred monolayers. It was also observed that hydrophobic interactions between the enzyme and the nonpolar groups of the carboxylic acid produced conformational changes in the secondary structure of the PDH, evidenced by the appearance of β-sheet spectral bands (infrared and DC). The mixed film's ability to detect the amino acid L-phenylalanine at a fixed concentration of 2.5 mM was tested in glycine buffer (pH 10.4) using the UV-vis spectroscopy technique, with an activity of 7.2x10-4 min-1 for the 15-layered structure. Thus, it was possible to verify, as a proof of concept, that the production of stable Langmuir films of the PDH enzyme in the presence of stearic acid can be employed in the construction of LB films capable of detecting the amino acid L-phenylalanine.