Análises de glicoesfingolipídeos em diferentes espécies do fungo patogênico do gênero Aspergillus
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Data
2018-06-28
Autores
Rodrigues, Karolina Marques [UNIFESP]
Orientadores
Takahashi, Helio Kiyoshi [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
incidence of serious fungal infections has increased in the last decade,
mainly due to the increase in the number of immunocompromised patients,
representing a serious cause of morbidity and mortality in this population. Recent
works show that fungi are vulnerable to inhibitors of sphingolipid biosynthesis,
which led us to study the structures of fungal glycosphingolipids, in order to obtain
relevant information on the biosynthesis and functional roles of these molecules
and to propose new potential targets for antifungal treatment.
Glycosylinositol phosphorilceramides (GIPCs), inositolphosphoryl
ceramides (IPCs), and monohexosyl ceramides (CMHs) from A. fumigatus, A.
flavus, A. niger and A. nidulans, filamentous fungi causing aspergillosis, were
extracted, purified and characterized using methods chromatography,
biochemistry and mass spectrometry. By mass spectrometry using electrospray
ionization (EISMS)
in positive mode, two major peaks corresponding to CMHs of
754 m/z and 756 m/z were identified for all species analyzed. By collisioninduced
dissociation (CID), m/z fragments of m/z: 736, 574, 556 and 276 were identified for
CMH 754 m/z. Similarly for CMH m/z 756 fragments of m/z 738, 576, 558 and 276.
The fragmentation pattern for both CMHs corresponds respectively to [M+H1H2O]+,
[M+H1H2OHex]+,
[M+H2H2OHex]+,
[M+H2H2Oacyl]+,
the fragments
associated with ceramidecontaining
CMH, with structures not described in
mammalian CMH, d19:2/h18:1 and d19:2/18:0, respectively. Glucosylceramide
and galactosylceramide were characterized by high resolution thin layer
chromatography (HPTLC).
It was possible to identify 2 different species of IPCs [M+H]+, 926 m/z, and
954 m/z, presenting 282 m/z and 310 m/z fragments for sphingosine t18:0 and
t20:0, respectively. The presence of inositol was confirmed using 241 m/z
precursor ion mass spectrometry, referring to the inositol phosphate group of
these structures. For the characterization of the GIPCs in the different Aspergillus
species, we used collision induced dissociation (DIC) in tandem MS with eletrotron
ionization (ESI), in positive mode [M+H]+. In this way we were able to detect the
1088 m/z and 1116 m/z ions corresponding to GIPCs with 1 hexose; 1250 m/z and
1278 m/z, GIPCs with 2 hexoses; 1412 m/z and 1440 m/z, corresponding to GIPCs containing 3 hexoses. The GIPCs present A. fumigatus, A. flavus and A.
niger were derived from the IPC 926 m/z (containing ceramide 666 m/z) and the
IPC 954 m/z (containing ceramid 694 m/z), on the other hand, the A. nidulans
GIPCs are derived only from the IPC 926 m/z. The presence of galactofuranose
residues in GIPCs was confirmed using the monoclonal antibody MEST1
which
recognizes terminal residues of galactofuranose. By immunostaining the HPTLC
plates with MEST1
the A. fumigatus, A. flavus and A. niger GIPCs, which had a
component recognized by mAb MEST1,
have the same chromatographic
migration as GIPC called Pb1
of Paracoccidioides brasiliensis. As for A. nidulans,
only small reactivity with mAb MEST1
was detected.
These results indicate that in the four species studied, both CMHs, IPCs
and GIPCs have structures not expressed in mammals, indicating that these
molecules as well as the specific enzymes involved in the metabolism of these
sphingolipids can be considered as targets for antifungal treatment .
A incidência de infeções fúngicas graves tem aumentado na última década, principalmente devido ao aumento do número de doentes imunodeprimidos, representando uma séria causa de morbidade e mortalidade nesta população. Trabalhos recentes mostram que os fungos são vulneráveis a inibidores da biossíntese de esfingolipídeos, o que nos levou a estudar as estruturas de glicoesfingolípideos fúngicos, visando obter informacões relevantes sobre a biossíntese e papéis funcionais dessas moléculas e propor novos alvos potenciais para tratamento antifungico. Glicosilinositol fosforilceramidas (GIPCs), inositolfosforilceramidas (IPCs), e monohexosil ceramidas (CMHs) de A. fumigatus, A. flavus, A. niger e A. nidulans, fungos filamentosos causadores da aspergilose, foram extraídos, purificados e caracterizados utilizandose métodos cromatográficos, bioquímicos e espectrometria de massas. Por espectrometria de massas utilizando ionização por eletrospray (EISMS), em modo positivo, foram identificados para todas as espécies analisadas dois picos majoritários correspondentes aos CMHs 754 m/z e 756 m/z. Por dissociação induzida por colisão (CID) foram identificados para o CMH 754 m/z fragmentos de m/z: 736, 574, 556 e 276. De maneira semelhante para CMH m/z 756, foram identificados fragmentos de m/z 738, 576, 558 e 276. O padrão de fragmentação para ambas as CMHs corresponde, respectivamente, a [M+H1H2O]+, [M+H1H2OHex]+, [M+H2H2OHex]+, [M+H2H2Oacil]+, sendo os fragmentos associados com CMH contendo ceramida, com estruturas não descritas em CMH de mamíferos, d19:2/h18:1 e d19:2/18:0, respectivamente. Glucosilceramida e galactosilceramida foram caracterizadas por cromatografia de alta resolução em camada delgada (HPTLC). Foi possível identificar 2 espécies diferentes de IPCs [M+H]+, 926 m/z, e 954 m/z, apresentando fragmentos 282 m/z e 310 m/z referentes a esfingosina t18:0 e t20:0, respectivamente. A presença de inositol foi confirmada utilizando espectrometria de massas em modo do íon precursor para 241 m/z, referente ao grupo inositol fosfato dessas estruturas. Para a caracterização dos GIPCs nas diferentes espécies de Aspergillus, utilizamos a dissociação induzida por colisão (CID) em tandem MS com ionização por eletropray (ESI), no modo positivo [M+H]+. Desta maneira pudemos detectar os íons 1088 m/z e 1116 m/z que correspondem a GIPCs com 1 hexose; 1250 m/z e 1278 m/z, GIPCs com 2 hexoses; 1412 m/z e 1440 m/z, que correspondem a GIPCs contendo com 3 hexoses. Os GIPCs presentes A. fumigatus, A. flavus e A. niger derivam do IPC 926 m/z (contendo ceramida 666 m/z) e do IPC 954 m/z (contendo ceramida 694 m/z),por outro lado, os GIPCs de A. nidulans derivam apenas do IPC 926 m/z. A presença de resíduos de galactofuranose nos GIPCs, foi confirmada utilizando o anticorpo monoclonal MEST1 que reconhece resíduos terminais de galactofuranose. Pela imunocoloração das placas de HPTLC com MEST1 os GIPCs de A. fumigatus, A. flavus e A. niger, que apresentaram um componente reconhecido pelo mAb MEST1, que possuem a mesma migração cromatográfica que o GIPC denominado Pb1 de Paracoccidioides brasiliensis. Já para o A. nidulans, somente pequena reatividade com mAb MEST1 foi detectada. Estes resultados indicam que, nas quatro espécies estudadas, tanto os CMHs, quanto os IPCs e GIPCs, apresentam estruturas não expressas em mamíferos, indicando que estas moléculas bem como as enzimas específicas envolvidas no metabolismo desses esfingolipídeos, podem ser considerados como alvos para tratamento antifúngico.
A incidência de infeções fúngicas graves tem aumentado na última década, principalmente devido ao aumento do número de doentes imunodeprimidos, representando uma séria causa de morbidade e mortalidade nesta população. Trabalhos recentes mostram que os fungos são vulneráveis a inibidores da biossíntese de esfingolipídeos, o que nos levou a estudar as estruturas de glicoesfingolípideos fúngicos, visando obter informacões relevantes sobre a biossíntese e papéis funcionais dessas moléculas e propor novos alvos potenciais para tratamento antifungico. Glicosilinositol fosforilceramidas (GIPCs), inositolfosforilceramidas (IPCs), e monohexosil ceramidas (CMHs) de A. fumigatus, A. flavus, A. niger e A. nidulans, fungos filamentosos causadores da aspergilose, foram extraídos, purificados e caracterizados utilizandose métodos cromatográficos, bioquímicos e espectrometria de massas. Por espectrometria de massas utilizando ionização por eletrospray (EISMS), em modo positivo, foram identificados para todas as espécies analisadas dois picos majoritários correspondentes aos CMHs 754 m/z e 756 m/z. Por dissociação induzida por colisão (CID) foram identificados para o CMH 754 m/z fragmentos de m/z: 736, 574, 556 e 276. De maneira semelhante para CMH m/z 756, foram identificados fragmentos de m/z 738, 576, 558 e 276. O padrão de fragmentação para ambas as CMHs corresponde, respectivamente, a [M+H1H2O]+, [M+H1H2OHex]+, [M+H2H2OHex]+, [M+H2H2Oacil]+, sendo os fragmentos associados com CMH contendo ceramida, com estruturas não descritas em CMH de mamíferos, d19:2/h18:1 e d19:2/18:0, respectivamente. Glucosilceramida e galactosilceramida foram caracterizadas por cromatografia de alta resolução em camada delgada (HPTLC). Foi possível identificar 2 espécies diferentes de IPCs [M+H]+, 926 m/z, e 954 m/z, apresentando fragmentos 282 m/z e 310 m/z referentes a esfingosina t18:0 e t20:0, respectivamente. A presença de inositol foi confirmada utilizando espectrometria de massas em modo do íon precursor para 241 m/z, referente ao grupo inositol fosfato dessas estruturas. Para a caracterização dos GIPCs nas diferentes espécies de Aspergillus, utilizamos a dissociação induzida por colisão (CID) em tandem MS com ionização por eletropray (ESI), no modo positivo [M+H]+. Desta maneira pudemos detectar os íons 1088 m/z e 1116 m/z que correspondem a GIPCs com 1 hexose; 1250 m/z e 1278 m/z, GIPCs com 2 hexoses; 1412 m/z e 1440 m/z, que correspondem a GIPCs contendo com 3 hexoses. Os GIPCs presentes A. fumigatus, A. flavus e A. niger derivam do IPC 926 m/z (contendo ceramida 666 m/z) e do IPC 954 m/z (contendo ceramida 694 m/z),por outro lado, os GIPCs de A. nidulans derivam apenas do IPC 926 m/z. A presença de resíduos de galactofuranose nos GIPCs, foi confirmada utilizando o anticorpo monoclonal MEST1 que reconhece resíduos terminais de galactofuranose. Pela imunocoloração das placas de HPTLC com MEST1 os GIPCs de A. fumigatus, A. flavus e A. niger, que apresentaram um componente reconhecido pelo mAb MEST1, que possuem a mesma migração cromatográfica que o GIPC denominado Pb1 de Paracoccidioides brasiliensis. Já para o A. nidulans, somente pequena reatividade com mAb MEST1 foi detectada. Estes resultados indicam que, nas quatro espécies estudadas, tanto os CMHs, quanto os IPCs e GIPCs, apresentam estruturas não expressas em mamíferos, indicando que estas moléculas bem como as enzimas específicas envolvidas no metabolismo desses esfingolipídeos, podem ser considerados como alvos para tratamento antifúngico.