Moléculas de microdomínios de membrana de fungos relevantes para a infectividade
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Data
2018-09-27
Autores
Lacerda Filho, Tanil Gois [UNIFESP]
Orientadores
Takahashi, Helio Kiyoshi [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Membrane microdomains represent a membrane fraction enriched with
glycosphingolipids, sterols and specific glycoproteins and they play a key role in
several biological events such as the infectivity of pathogenic fungi. In the past
few years we have characterized yeast membrane microdomains of
Histoplasma capsulatum, and we have shown that these regions are enriched
with specific proteins such as the 32 kDa lamininbinding
protein (p32). Also we
have shown that the removal of ergosterol from the plasma membrane with
methylβcyclodextrin
(mβCD) reduces significantly the ability of H. capsulatum
to infect alveolar macrophages. The p32 was isolated from membrane fractions
resistant to nonionic
detergent (Brij 1% at 4ºC) obtained by sucrose gradient
ultracentrifugation and by immunoprecipitation with laminin and antilaminin
antibodies conjugated to SepharoseproteinA.
The immunoprecipitate was
submitted to SDSPAGE
and the band corresponding to p32 isolated from the
gel, submitted to tryptic digestion. The five tryptic fragments were analyzed by
mass spectrometry and it was characterized by Mascot software and the
database from NCBI. In order to investigate whether other components of
fungal membrane microdomains, such as glucosylceramide could also
modulate infectivity, we performed experiments using Candida albicans control
yeasts and protoplasts obtained after Zymolase treatment (2mg/ml 2
hours)
and immunostaining with antiglucosylceramide
antibody (MEST2).
By confocal
microscopy we observed distribution differences of glucosylceramide between
protoplasts and control yeasts. In the interaction of C. albicans protoplasts with
host cells (1h incubated with macrophages cultures) a polarization of the
protoplast glucosylceramide was observed in the region of interaction with the macrophage, not detected in control yeasts. The data presented here may help
future studies on the interaction fungi/host cell and eventually help the
development of new drugs acting on infections caused by this class of fungi.
Microdomínios de membrana são frações de membrana enriquecidas em glicoesfingolipídeos, esteróis e (glico)proteínas específicas; podendo desempenhar papel fundamental em vários eventos biológicos como na infectividade de fungos patogênicos. Durante o mestrado caracterizamos microdomínios de membrana de leveduras de Histoplasma capsulatum, demonstramos que essas regiões apresentam uma proteína de 32 kDa ligante à laminina (p32) e que a remoção de ergosterol da membrana plasmática com metilβciclodextrina (mβCD), desestabiliza os microdomínios, reduzindo a capacidade de H. capsulatum de infectar macrófagos alveolares. p32 foi isolada de frações de membranas resistentes a detergente não iônico (Brij 1% à 4˚C) obtidas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose e por imunoprecipitação com laminina e anticorpos antilaminina conjugados à SepharoseproteínaA. O imunoprecipitado foi submetido à SDSPAGE, a banda correspondente a p32 isolada do gel, submetida à digestão tríptica e os cinco fragmentos obtidos analisados por espectrometria de massas, e caracterizados pelo software MASCOT com o auxílio do banco de dados do NCBI. Com o objetivo de investigar se outros componentes de microdomínios de membrana de fungos, como a glucosilceramida, poderiam também modular a infectividade, realizamos experimentos utilizando leveduras controles e protoplastos de Candida albicans obtidos após tratamento com Zymolase (2mg/ml – 2 horas) e imunomarcação com anticorpos antiglucosilceramida (MEST2). Por microscopia confocal observamos diferenças significativas da distribuição da glucosilceramida nos protoplastos e nas leveduras controle. Durante a interação de protoplastos de C. albicans (incubados 1h com culturas de macrófagos) foi observada uma polarização da distribuição da glucosilceramida dos protoplastos para a região da interação com o macrófago; não observada em leveduras controle. Esses dados podem auxiliar futuros estudos sobre a interação fungo/hospedeiro e eventualmente contribuir para o desenvolvimento de novos medicamentos contra infecções causadas por estes fungos.
Microdomínios de membrana são frações de membrana enriquecidas em glicoesfingolipídeos, esteróis e (glico)proteínas específicas; podendo desempenhar papel fundamental em vários eventos biológicos como na infectividade de fungos patogênicos. Durante o mestrado caracterizamos microdomínios de membrana de leveduras de Histoplasma capsulatum, demonstramos que essas regiões apresentam uma proteína de 32 kDa ligante à laminina (p32) e que a remoção de ergosterol da membrana plasmática com metilβciclodextrina (mβCD), desestabiliza os microdomínios, reduzindo a capacidade de H. capsulatum de infectar macrófagos alveolares. p32 foi isolada de frações de membranas resistentes a detergente não iônico (Brij 1% à 4˚C) obtidas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose e por imunoprecipitação com laminina e anticorpos antilaminina conjugados à SepharoseproteínaA. O imunoprecipitado foi submetido à SDSPAGE, a banda correspondente a p32 isolada do gel, submetida à digestão tríptica e os cinco fragmentos obtidos analisados por espectrometria de massas, e caracterizados pelo software MASCOT com o auxílio do banco de dados do NCBI. Com o objetivo de investigar se outros componentes de microdomínios de membrana de fungos, como a glucosilceramida, poderiam também modular a infectividade, realizamos experimentos utilizando leveduras controles e protoplastos de Candida albicans obtidos após tratamento com Zymolase (2mg/ml – 2 horas) e imunomarcação com anticorpos antiglucosilceramida (MEST2). Por microscopia confocal observamos diferenças significativas da distribuição da glucosilceramida nos protoplastos e nas leveduras controle. Durante a interação de protoplastos de C. albicans (incubados 1h com culturas de macrófagos) foi observada uma polarização da distribuição da glucosilceramida dos protoplastos para a região da interação com o macrófago; não observada em leveduras controle. Esses dados podem auxiliar futuros estudos sobre a interação fungo/hospedeiro e eventualmente contribuir para o desenvolvimento de novos medicamentos contra infecções causadas por estes fungos.