O efeito do tratamento com carnosina durante o processamento seminal de amotras humanas por gradiente de densidade descontínuo

Abstract

Introduction: Male infertility can be caused by seminal oxidative stress that lead to sperm damages. However, seminal plasma contains antioxidants mechanisms responsible for avoiding these cellular damages. On the other hand, biotechniques used during seminal processing tend to decrease such antioxidant protection. In an attempt to minimize damage, exogenous antioxidants are supplemented in in vitro systems. Carnosine, previously reported for its potent antioxidant function, has the ability to react with products responsible for causing cellular damage. Thus, supplementing carnosine in the medium of seminal processing would lead to an improvement on sperm functional quality. Objective: To evaluate the effect of different concentrations of carnosine during human seminal process. Method: The seminal sample from 34 patients were divided into 3 groups and followed to seminal process: control group without carnosine supplementation (0) received two layers of discontinuous density gradient – Percoll (80% e 40%) and sample; the 20Mm group, received the layers of Percoll supplemented with 20 mM of carnosina; and, the 50mM group had the layers of Percoll supplemented with 50 mM of carnosine. The sample passed by discontinuous density gradient for 20 minutes at 600xG and washed with human tubal fluid medium (HTF) for 10 minutes at 600 xG. After that, the spermatozoa were evaluated according to mitochondrial membrane potential, intracellular superoxide anion production, sperm DNA fragmentation, acrosome integrity, mitochondrial activity, plasma membrane integrity, and motility. Analyzing the data normality and sphericity, we used the Kolmogorov-Smirnov test and Mauchly test respectively, so we also used General Linear Model (GLM) with Sidak post-hoc test. To not normal data we used nonparametric Friedman test with Games-Howell post-hoc test considering α = 5% and using the SPSS21 software. Results: The carnosine supplementation with 50 mM lead to improve of sperm mitochondrial activity when compared to control group. Variable such as % of sperm motile, % sperm progressive, VAP, VSL, VCL and LIN showed an improvement after the discontinuous density gradient, however the carnosine concentrations wasn’t effectives. To BCF, the both concentration of carnosine increased the frequency when compared to samples before discontinuous density gradient. Conclusion: The carnosine supplementation in seminal samples can show benefit effect to sperm mitochondrial activity and beat cross frequency, decreasing possible damages caused by seminal processing.

Introdução: A infertilidade masculina pode ser causada pelo estresse oxidativo seminal que leva prejuízos aos espermatozoides. Entretanto, o plasma seminal possui mecanismos antioxidantes para tentar neutralizar esses danos celulares. Por outro lado, as biotécnicas utilizadas durante o processamento seminal tendem a diminuir essa proteção antioxidante aumentando os danos oxidativos ao gameta. Na tentativa de minimizar os danos, antioxidantes exógenos são suplementados nos sistemas in vitro. A carnosina, reportada por sua potente função antioxidante, tem capacidade de reagir com produtos responsáveis por provocar danos celulares. Dessa forma suplementar carnosina nos meios de processamento seminal levaria a uma melhora na qualidade funcional dos espermatozoides. Objetivo: Avaliar o efeito de diferentes concentrações da carnosina no processamento das amostras seminais. Método: As amostras seminais (n=34) foram divididas em 3 grupos e seguiram para o processamento seminal: grupo controle sem suplementação com a carnosina (0) recebeu as camadas de gradiente de densidade descontínua – Percoll (80% e 40%) e a amostra; o grupo 20 mM, por sua vez, teve as camadas de Percoll suplementadas com 20 mM de carnosina; finalmente, o grupo 50mM teve as camadas de Percoll suplementadas com 50 mM de carnosina. As amostras passaram pelo processo de gradiente de densidade descontínuo por 20 minutos a 600xG e foram lavadas com meio de cultura fluido tubário humano (HTF) por 10 minutos a 600xG. Após o processamento, os espermatozoides foram avaliados quanto ao potencial de membrana mitocondrial, à produção de ânion superóxido intracelular, à fragmentação de DNA espermático, à integridade acrossômica, à atividade mitocondrial, à integridade de membrana plasmática e à motilidade espermática. Para analisar a normalidade e esfericidade dos dados, utilizamos os testes de Kolmogorov-Smirnov e de Mauchly respectivamente, e então o General Linear Model (GLM) com teste post-hoc de Sidak. Para as variáveis não normais foi utilizado o teste não paramétrico de Friedman com post-hoc de Games-Howell, considerando α = 5% e utilizando o programa SPSS21. Resultados: A suplementação com a carnosina na concentração de 50 mM levou à melhora da atividade mitocondrial dos espermatozoides quando comparado ao grupo controle. Para variáveis como % de espermatozoides móveis e % de espermatozoides progressivos, velocidade média de percurso, retilínea e curvilínea, e linearidade dos espermatozoides houve uma melhora nos índices após o gradiente de densidade descontínuo, entretanto as concentrações de carnosina não foram efetivas. Já para a frequência de batimento dos flagelos a presença de carnosina em ambas concentrações elevou as frequências quando comparadas à amostra antes do gradiente de densidade descontínuo. Conclusão: A suplementação da carnosina nas amostras seminais humanas pode apresentar efeito benéfico para a atividade mitocondrial espermática e a frequência de batimento cruzado, amenizando os possíveis danos provocados pelo processamento seminal.