Potencial antitumoral de marsdenia cundurango Reichenbach F. em modelos de carcinoma mamário
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Data
2018-04-26
Autores
Spindola, Daniel Gonsales [UNIFESP]
Orientadores
Trindade, Claudia Bincoletto [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Marsdenia cundurango Reichenbach F. is a South American medicinal plant, from the Asclepiadoideae family, popularly used in treatment of stomach cancer, digestive problems and due to its anti-inflammatory and antioxidant actions. The objective of this work was to evaluate antiproliferative and antitumor activity of crude extract of Marsdenia cundurango Reichenbach F. (EBMC) and its chloroform, hexane and dichloromethane fractions obtained from organic solvents in two mammary carcinoma cell lines, MCF7 and 4T1. Cell viability was assessed after 24 hours exposure to EBMC and its fractions by trypan blue exclusion and MTT reduction assays. It was carried out the analysis of the constituents of the EBMC by UHPLC and its antioxidant profile is evaluated by the DPPH method. The incorporation of propidium iodide (PI), double-labeling with Annexin-V-FITC / PI, generation of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential by DCF-DA and TMRE, respectively, and evaluation of caspase-3 activation in the 4T1 cell line, both by flow cytometry. Nuclear morphology analysis by Hoechst staining was performed by fluorescence microscopy, and the semi-quantication of Bax and Bcl-2 proteins by Western blotting. The cytosolic calcium increase was evaluated as well as an in vivo assay to evaluate the ability to reduce tumor progression in BALB / c mice. Our results demonstrated that EBMC, but not its fractions, was cytotoxic to MCF7 and 4T1 cells with the ability to reduce cell viability by 50% at a concentration of 100 μg/mL. The characterization of EBMC revealed the presence of active glycosides in it, the Condurangogligosídeos. Cell death assays demonstrated that EBMC increased the sub-G1 fraction and induced cell death, mostly late apoptosis, significantly. EBMC was also able to reduce tumor volume in in vivo assay. In addition, the nuclear morphology analysis revealed the presence of pycnotic nuclei, suggesting the occurrence of cell death. These events were accompanied by increased ROS production, decreased mitochondrial membrane potential, increased levels of Bax protein expression and decreased Bcl-2, and increased cytosolic calcium in both cell lines and activation of caspase-3 in the 4T1 cells. Thus, we conclude that EBMC has induced programmed cell death in MCF7 and 4T1 cells, and it is promising for future studies and clinical applications.
A Marsdenia cundurango Reichenbach F. é uma planta medicinal sul americana da família Asclepiadoideae popularmente utilizada no tratamento do câncer de estômago, problemas digestivos e por sua ação anti-inflamatória e antioxidante. Neste trabalho foi avaliada a citotoxicidade do extrato bruto da casca de Marsdenia cundurango Reichenbach F. (EBMC) e de suas frações clorofórmica, hexânica e diclorometano em duas linhagens celulares de carcinoma mamário, MCF7 e 4T1 . A viabilidade celular foi avaliada após a exposição de 24 horas ao EBMC e suas frações por meio dos ensaios de exclusão por azul de tripano e de redução de MTT. Foi realizada a análise dos constituintes do EBMC por UHPLC e seu perfil antioxidante estudados pelo método do DPPH. Foram realizados os ensaios de iodeto de propídeo (PI), dupla marcação com Anexina-V-FITC/PI, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e o potencial de membrana mitocondrial por marcação com DCF-DA e TMRE, respectivamente, e avaliação de ativação de caspase-3 na linhagem 4T1, ambos por citometria de fluxo. A análise de morfologia nuclear por Hoechst foi realizada por microscopia de fluorescência, e a semi-quanticação das proteínas Bax e Bcl-2 por Western blotting. Foi ainda avaliado o aumento de Cálcio citosólico, além de ensaio in vivo para avaliar a capacidade de redução da progressão tumoral em camundongos. O EBMC, mas não suas frações, foi citotóxico para as células MCF7 e 4T1 com capacidade de reduzir a viabilidade celular em 50% com uma concentração de 100 μg/mL. A caracterização do EBMC revelou a presença de glicosídeos ativos, os Condurangogligosídeos. Os ensaios de morte celular demonstraram que o EBMC aumentou a fração sub-G1 e induziu morte celular, majoritariamente apoptose tardia, de forma significativa. O EBMC reduziu o volume tumoral no ensaio in vivo. Além disso, a análise de morfologia nuclear revelou a presença de núcleos picnóticos, sugerindo a ocorrência de morte celular. Estes eventos foram acompanhados por aumento de EROs, diminuição do potencial de membrana mitocondrial, aumento dos níveis de expressão proteica de Bax e diminuição de Bcl-2 com aumento de cálcio citosólico em ambas as linhagens, além da ativação de caspase-3 na linhagem 4T1. Concluímos que o EBMC possui atividade antitumoral em ensaios in vivo e in vitro, sugerindo a necessidade de futuros estudos visando sua aplicação clínica.
A Marsdenia cundurango Reichenbach F. é uma planta medicinal sul americana da família Asclepiadoideae popularmente utilizada no tratamento do câncer de estômago, problemas digestivos e por sua ação anti-inflamatória e antioxidante. Neste trabalho foi avaliada a citotoxicidade do extrato bruto da casca de Marsdenia cundurango Reichenbach F. (EBMC) e de suas frações clorofórmica, hexânica e diclorometano em duas linhagens celulares de carcinoma mamário, MCF7 e 4T1 . A viabilidade celular foi avaliada após a exposição de 24 horas ao EBMC e suas frações por meio dos ensaios de exclusão por azul de tripano e de redução de MTT. Foi realizada a análise dos constituintes do EBMC por UHPLC e seu perfil antioxidante estudados pelo método do DPPH. Foram realizados os ensaios de iodeto de propídeo (PI), dupla marcação com Anexina-V-FITC/PI, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e o potencial de membrana mitocondrial por marcação com DCF-DA e TMRE, respectivamente, e avaliação de ativação de caspase-3 na linhagem 4T1, ambos por citometria de fluxo. A análise de morfologia nuclear por Hoechst foi realizada por microscopia de fluorescência, e a semi-quanticação das proteínas Bax e Bcl-2 por Western blotting. Foi ainda avaliado o aumento de Cálcio citosólico, além de ensaio in vivo para avaliar a capacidade de redução da progressão tumoral em camundongos. O EBMC, mas não suas frações, foi citotóxico para as células MCF7 e 4T1 com capacidade de reduzir a viabilidade celular em 50% com uma concentração de 100 μg/mL. A caracterização do EBMC revelou a presença de glicosídeos ativos, os Condurangogligosídeos. Os ensaios de morte celular demonstraram que o EBMC aumentou a fração sub-G1 e induziu morte celular, majoritariamente apoptose tardia, de forma significativa. O EBMC reduziu o volume tumoral no ensaio in vivo. Além disso, a análise de morfologia nuclear revelou a presença de núcleos picnóticos, sugerindo a ocorrência de morte celular. Estes eventos foram acompanhados por aumento de EROs, diminuição do potencial de membrana mitocondrial, aumento dos níveis de expressão proteica de Bax e diminuição de Bcl-2 com aumento de cálcio citosólico em ambas as linhagens, além da ativação de caspase-3 na linhagem 4T1. Concluímos que o EBMC possui atividade antitumoral em ensaios in vivo e in vitro, sugerindo a necessidade de futuros estudos visando sua aplicação clínica.
Descrição
Citação
SPINDOLA, Daniel Gonsales. Avaliação do potencial antitumoral de Marsdenia cundurango Reichenbach F. em modelos de carcinoma mamário. 2018. 97 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2018.