Perfil redox sazonal e o papel do fluido folicular na maturação de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico

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Data
2017-09-27
Autores
Rodrigues, Thais Alves [UNIFESP]
Orientadores
Lopes, Fabiola Freitas de Paula [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Heat stress promotes changes in reproductive microenvironment, compromising the oocyte and embryos development. High temperature alters cells redox balance. However, it is not know how the temperature affects the oocyte microenvironment as wells as the role of follicular fluid (FF) in heat-shocked oocytes. The aim of the first experiment was to determine the effect of seasonal heat stress in the activity of antioxidant enzymes, lipid peroxidation and total protein in bovine FF. Glutathione peroxidase activity was reduced in FF collected in summer compared to winter. However, there was no effect on superoxide dismutase and lipid peroxidation. There was a tendency of total protein reduction in FF in summer. In the second series of experiments, the heat stress was applied in vitro (heat shock). The aim of those experiments was to determine the role of FF in cumulus cells (CCs) expansion, nuclear maturation, protein quinase activated by mitogens (MAPK) activity, oxygen reactive species (ROS) production and developmental competence of bovine oocytes subjected to heat shock during in vitro maturation (IVM). Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from slaughterhouse ovaries and distributed to the treatments heat shock (41ºC for 14 h followed by 38.5°C for 8 h) or control (38.5ºC for 22 h) in the presence of 0, 10 or 15% FF. For CCs expansion evaluation, images before and after COCs IVM were acquired. The oocytes were stained with 5 μg/ml Hoechst 33342 to evaluate nuclear maturation. Heat shock reduced CCs expansion and nuclear maturation. However, supplementation of IVM medium with 10% FF reverted these deleterious effects. MAPK activity was determined by Western Blotting. There was no effect of heat shock or FF in oocyte MAPK activity. However, heat shock enhanced MAPK activity in CCs and 10% FF was capable of reverting this effect. Heat shock also reduced the number of cleaved oocytes and the percentage of blastocyst. However, addition of 10% FF reverted this effect. The third series of experiments determined the role of FF exosomes in CCs expansion and embryos development competence in oocytes subjected to heat shock during IVM. Exosomes were isolated by ultracentrifugation. Heat shock reduced the expansion of CCs, cleavage and blastocyst rates. However, supplementation with FF exosomes (16 x 109 particles/ml) reverted this effect. Heat shock did not affect gene expression in blastocysts. In addition, exosomes reduced expression of NANOG and enhanced the expression of SOX2, indicating that exosome supplementation accelerated the embryo development. Exosomes were uptaken by CCs and not by the oocyte, indicating that the thermoprotective effect of FF can be mediated by exosomes via CCs. In conclusion, the moderate increase in environmental temperature is capable of changing the antioxidant system in follicular fluid. In addition, exposure of oocytes to heat shock during IVM showed a negative impact in CCs expansion, nuclear maturation, MAPK activity and embryo development. However, both FF and exosomes were capable of reverting the heat stress deleterious effects.
O estresse térmico promove mudanças no microambiente do trato reprodutivo, comprometendo o oócito bem como o desenvolvimento embrionário pré-implantacional. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos da temperatura no microambiente folicularoocitário bem como o papel do fluido folicular (FF) em oócitos submetidos ao choque térmico. O primeiro experimento visou explorar o efeito do estresse térmico sazonal no perfil de atividade de enzimas antioxidantes, peroxidação lipídica e proteína total no FF de bovinos. A atividade da enzima antioxidante glutationa peroxidase foi reduzida no FF coletado no verão em relação ao inverno. Houve uma tendência de redução na concentração de proteína total no FF nos meses mais quentes do ano. Na segunda série de experimentos o estresse térmico foi aplicado in vitro (choque térmico). Estes experimentos visaram determinar o papel do FF na função de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico durante a maturação in vitro (MIV). Para tanto, os complexos cumulusoócito (CCOs) coletados de ovários de abatedouro (folículos de 2-8 mm) foram distribuídos nos tratamentos controle (38,5ºC por 22 horas) ou choque térmico (41ºC por 14 horas seguido de 38,5°C por 8 horas) na presença de 0, 10 e 15% de FF. O choque térmico reduziu a expansão das células do cumulus (CCs) e a maturação nuclear. No entanto, a suplementação do meio de MIV com 10% de FF reverteu esses efeitos deletérios. Não houve efeito do choque térmico e do FF na atividade de proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) em oócitos. Em contrapartida, o choque térmico aumentou a atividade de MAPK nas CCs e o FF (10%) reverteu esse efeito. Quando os oócitos submetidos ao choque térmico durante a MIV foram fecundados e cultivados in vitro houve redução na clivagem embrionária, na proporção de oócitos e embriões clivados que atingiram o estágio de blastocisto. No entanto, a adição de 10% FF reverteu esses efeitos deletérios. A terceira série de experimentos demonstrou o papel dos exossomos do FF na expansão das CCs e na competência de desenvolvimento de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico durante a MIV. Para tanto os exossomos foram extraídos do FF por ultracentrifugação, caracterizados e quantificados. O choque térmico reduziu a expansão das CCs, a taxa de clivagem e de blastocisto, enquanto a suplementação com exossomos do FF (16 x 109 partículas/ml) reverteu esse efeito. O choque térmico durante a MIV não afetou a expressão gênica no blastocisto. A adição dos exossomos reduziu a expressão de NANOG e aumentou a expressão de SOX2, indicando que a suplementação dos oócitos com exossomos acelerou o desenvolvimento embrionário subsequente. Os exossomos foram captados pelas CCs, mas não pelo oócito, indicando que os efeitos termoprotetores do FF podem ser mediados pelos exossomos através das CCs. Em conclusão, o aumento moderado da temperatura ambiental é capaz de alterar o sistema antioxidante no fluido folicular. Além disso, a exposição de oócitos ao choque térmico durante a MIV demonstrou efeitos deletérios na expansão das CCs, maturação nuclear, atividade de MAPK nas CCs e desenvolvimento embrionário. No entanto, o FF assim como os exossomos do FF, reverteram esses efeitos deletérios
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